| 研究課題/領域番号 |
01044117
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
山村 研一 熊本大学, 医学部, 教授 (90115197)
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| 研究分担者 |
増井 禎夫 トロント大学, 動物学部, 教授
マーカート クレメント ノースカロライナ大学, 動物科学部, 教授
若杉 正司 熊本大学, 医学部, 助手 (50201140)
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| キーワード | 挿入突然変異マウス / トランスジェニックマウス / ネオ耐性遺伝子 / 受精卵 / 遺伝子トラップ |
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| 研究概要 |
挿入突然変異マウスに関し、トランスジ-ン挿入部位の5′端及び3′端側のマウスゲノムDNAを単離し、ヒトを含む他の哺乳類においても保存されている部分を同定した。これをプロ-ブとして、破壊されたマウス内在性遺伝子の同定と単離を試みている。
受精卵にネオ耐性遺伝子を選択マ-カ-遺伝子として含むトラップベクタ-を注入し、それが組込まれた時には2細胞期から胚盤胞に至る間にG418で選択できることを明らかにした。更に、プロモ-タ-を有しないネオ耐性遺伝子を用い、これがマウス内在性遺伝子の下流に組込まれた時にのみ発現するよう工夫したトラップベクタ-を受精卵に注入し、G418下で培養した。胚盤胞に至ったものを仮親の子宮に移植し、生まれたマウスにトラップベクタ-が組込まれているかどうかを解析したところ、90%以上の確率で組込まれていることが分かった。このことは、トラップベクタ-がマウス内在性遺伝子の下流に組込まれ、ネオ耐性遺伝子が発現しているもののみがG418にて選択されていることを示唆している。また、トラップベクタ-の下流にポリオ-マエンハンサ-を接続した方が遺伝子トラップを効率良く行なえることが分った。
ES細胞を用いた遺伝子トラップ用のベクタ-も作製した。この場合にはリポ-タ-遺伝子としてlac Zを用いた。またトラップ後のマウス内在性遺伝子の単離を容易にするため、トラップベクタ-にはプラスミドの配列も含ませた。このトラップベクタ-をES細胞に電気穿孔法にて導入し、G418選択ののちXーgal染色を行なった。ES細胞の時点で発現するが分化誘導後に消失するものを選び、レシピエントの胚盤胞に注入し、効率良く生殖キメラマウスを作製する条件を確立した。
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