発癌と細胞増殖制御における硫酸化チロシン蛋白質の機能解明

1991 年度 研究成果報告書概要

• 研究課題/領域番号: 01044119
• 研究種目: 国際学術研究
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 共同研究
• 研究機関: 宮崎大学
• 研究代表者: 中津 誠一郎 宮崎大学, 農学部, 教授 (70040805)
• 研究分担者: DECKER Stuar ロックフュラー大学, 生化学部, 助教授 ; MINGーCHEH Li オクラホマ大学, 理学部, 准教授 ; 西山 和夫 宮崎大学, 農学部, 助手 (40164610) ; 水光 正仁 宮崎大学, 農学部, 助教授 (00128357) ; LIU Ming-cheh The University of Oklahoma, U. S. A. Department of Chemistry and Biochemistry As ; STUART Decker J. The Rockefeller University, U. S. A. Department of Biochemistry Assistant Profes
• 研究期間 (年度): 1989 – 1991
• キーワード: 硫酸化チロシン / 翻訳後修飾 / ゴルジ体 / 牛肝臓 / 硫酸転移酵素 / オリゴペプチド / 硫酸化チラミン / レセプタ-

研究概要

細胞内で蛋白質が翻訳された後、そのうちのチロシンが硫酸化されることが近年発見された。本共同研究者らはウイルスにより誘導される癌細胞では正常細胞に比べ、蛋白質の硫酸化チロシンが激減することを見出した。また、遺伝子工学の分野でも翻訳後修飾の蛋白質の修飾が機能発現に極めて重要であることが明らかにされており、このチロシン硫酸化もその一つである。本プロジェクトでは蛋白質のチロシン硫酸化の機能解明と、チロシン硫酸化が発癌と細胞増殖制御にどのように関与しているかを解明することを目的として研究を行った。
本研究の主目的である硫酸化チロシン蛋白質が発癌と細胞増殖制御にどのように関与しているかを解明することに関して、チロシン硫酸化は、蛋白質の立体構造に強く影響を与え、それに伴い生理機能調節に関与している可能性が裏づけされた。また、ラット胚繊維芽細胞(3Y1)とヒト肝癌細胞HepG2を用いて硫酸化チロシン蛋白質が代謝され、細胞外に分泌されるフリ-の硫酸化チロシンを定量した際、両細胞とも多量のフリ-の硫酸化チロシンを分泌していることが判明した。興味のあることに肝癌細胞HepG2のみに硫酸化チラミンの存在を発見した。本化合物は神経伝達機能に重要な役目を持っていると思われている。
我々は現在までに牛肝臓のゴルジ体を多く含むミクロゾ-ム膜画分に硫酸化チロシン蛋白質に特異的なレセプタ-と考えられる膜結合TyrSーbinding protein(TyrSR)の存在を明らかにしており、同画分にこのレセプタ-が硫酸化チロシン蛋白質と複合体を形成し存在することが示されたことより、硫酸化チロシンをシグナルとし、レセプタ-を介在した分泌蛋白質の細胞内輸送系を提唱している。しかし分泌後の硫酸化チロシン蛋白質の挙動は現在のところ全く不明であるため、血液中に硫酸化チロシン蛋白質あるいはペプチドに対し特異的なキャリア-プロテインの存在を想定し、牛血清中のTyrSーbinding protein(TyrSBP)の検索及び単離精製を行い、その諸性質を検討した。その結果、硫酸化チロシン蛋白質に特異的に結合する分子量160kのBinding Proteinが得られた。
牛肝臓のゴルジ体から調製したTyrosylprotein sulfotransferase(TPST)はZーGluーTyrやBocーCCKー8など数種のオリゴペプチドを硫酸化し、TyrのN端側がAspの時Gluに比べ効率よく硫酸化し、Lysの場合硫酸化しないことを明らかにした。このことよりTPSTの基質の忍識はアミノ酸配列に依存していることが示唆された。しかしTPSTの分離・精製は極めて困難である。最適基質ペプチドの検索及びアフィニティ-クロマトグラフィ-のリガンドの検討のため、硫酸化チロシン蛋白質をモデルとした11種の基質オリゴペプチド及び硫酸体の合成、構造同定を行った。その結果、最適ペプチドBocーAspーTyrーValの合成に成功した。
ヒル由来の血液凝固阻害剤ヒルジンは63番目のTyrーのみ硫酸化を受けており、遺伝子工学的にE.coliまたは酵母が生産したヒルジンは硫酸化されていないため、in vitroでの硫酸化が必要とされる。牛肝臓由来のTPSTによる硫酸化を試みた結果、63番目のTyrのみの硫酸化に成功した。これらのことより、リコンビナント蛋白質の翻訳後修飾として、牛肝臓由来のTPSTを用いて特異的チロシン硫酸化が可能となった。
現在までのところフェノ-ル硫酸転移酵素(PST)は細胞質可溶性画分にのみその存在が報告されているが、ミクロゾ-ム画分には報告されていなかった。しかし、今回ミクロゾ-ム画分に新規の膜結合酵素の存在が示唆された。
以上の内容を米国生化学会、日本生化学会および日本農芸化学会等で発表したところ、生化学会においては、発癌と細胞増殖制御の観点から、また、農芸化学会においては、遺伝子工学の産物としての蛋白質の修飾と機能発現という観点から、注目をあびた。

研究成果

• [文献書誌] MingーCheh Liu: "TyrosineーOーSulfate,in Addition to TyrosineーOーSulfate,in Produced and Secreted by HePG2 Human Hepatoma Cells,But not by 3Y1 Embryo Fibroblasts." Biochemistry International. 21. 815-821 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Masahito Suiko: "Quantitative Determination of TyrosineーOーSulfate in Urin: Application of IonーPair ReverseーPhase High Performance Liquid Chromatography in the Analysis of TyrosineーOーSulfate." Clinica.Chimica.Acta.193. 193-198 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Masahito Suiko: "PostーTranslational Modification by Tyrosine Sulfation and Its Functions ー Does It Exist in Higher Plants" Proceeding of International Colloquium on Overcoming Breeding Barriers,Miyazaki. 59-65 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] MingーCheh Liu: "Possible Involvenent of Protein Tyrosine Sulfation in the Polarized Protein Sorting in FilterーGrown MadinーDarby Canine Kidney(MDCK)Cells." Proceeding of International Colloquium on Overcoming Breeding Barriers,Miyazaki. 67-68 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] MingーCheh Liu: "Identification of Complexes between the TyrosineーOーSulfateーBinding Protein and TyrosineーSulfated Proteins in Bovine Liver Membrane Lysate." Biochemical Journal. 275. 259-262 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Jian Rong Han: "PostーTranslational Modification and Binding Properties of the Apically Secreted 80 KDa Glycoーprotein from Madin Derby Canine Kidney Cells:" Archives of Biochemistry and Biophysics. 286. 337-345 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ruiliang Lu: "Purification and Characterization of a Membrane Bound TyrosineーOーSulfateーBinding Protein from Bovine Liver." Archives of Biochemistry and Biophysics. 286. 481-487 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yuji Kishima: "Betalain Pigmentation in Petal of Portulaca is Preceded by a Tyrosine Accumulation." Journal of Plant Physiology. 137. 505-506 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] P.H.Prasantha Fernando: "Protein Tyrosine Sulfation in Animal Cells and Its Simulation in vitro in the Downstream Processing of Proteins." Proceeding of the Fourth Annual Meeting and International Symposium of Japanese Association For Animal Cell Technology. (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] MingーCheh Liu: "Possible Involvement of Protein Tyrosine Sulfation in the Polarized Protein Sorting in FilterーGrown MadinーDarby Canine Kidney(MDCK)Cells." Proceeding of the Fourth Annual Meeting and International Symposium of Japanese Association For Animal Cell Technology.(1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] MingーCheh Liu: "Identification of a Putative TyrosineーOーSulfate Receptor and Its Presence in Complex Form with a Major TyrosineーSulfated Protein,the 80 KDa Glycoprotein in MadinーDarby Canine Kidney Cells." Journal of Biological Chemistry. (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] P.H.Prasantha Fernando: "Isolation and Characterization of a Novel(Microsomal)Membraneーbound Phenol Sulfotransーferase from Bovine Liver." Biochem.Biophys.Res.Commun.(1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yoichi Sakakibara: "Purification and Characterization of TyrosineーOーsulfateーbinding Protein from Bovine Serum." Arch.Biochem.Biophys.(1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Masahito Suiko: "The Role of Tyrosine Sulfation in Protein: Activities of Several Sulfatases on Tyrosine Sulfated Protein and Related Compounds." Journal Biochemistry. (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Masahito Suiko: "Postーtranslational Protein Modification by Tyrosine Sulfation: Biochemistry and Functional Role of a Bovine Liver TyrosineーOーSulfateーbinding Protein.The Postーtranslational Modification of Proteins" Japan Science Society Press,Tokyo, 19-34 (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ming-Cheh Liu: "Tyramine-O-Sulfate, in Addition to Tyrosine-O-Sulfate, is Produced and Secreted by HepG 2 Human Hepatoma Cells, But not by 3Y1 Rat Embryo Fibroblasts." Biochem. International. 21. 815-821 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Masahito Suiko: "Quantitative Determination of Tyrosine-O-sulfate in Urine : Application of Ion-Pair Reverse-Phase High Performance Liquid Chromatography in the Analysis of Tyrosine-O-sulfate." Clinica. Chimica. Acta.193. 193-198 (1990)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Masahito Suiko: "Post-Translational Modification by Tyrosine Sulfation and Its Functions-Does It Exist in Higher Plants?" Proceeding of International Colloquim on Overcoming Breeding Barriers, Miyazaki.59-65 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ming-Cheh Liu: "Possible Involvement of Protein Tyrosine Sulfation in the Polarized Protein Sorting in Filter-Grown Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) Cells." Proceeding of International Colloquim on Overcoming Breeding Barriers, Miyazaki. 67-68 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ming-Cheh Liu: "Identification of Complexes between the Tyrosine-O-Sulfate-Binding Protein and Tyrosine-Sulfated Proteins in Bovine Liver Membrane Lysate." Biochem. J.275. 259-262 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Masahito Suiko: "The Post-translational Modification of Proteins" Japan Sci. Soc. Press, Tokyo. 19-34 (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Jian Rong Han: "Post-Translational Modification and Binding Properties of the Apically Secreted 80 KDa Glycoprotein from Madin Derby Canine Kidney Cells : Similarities to the C-Terminal Portion of the Basolaterally Secreted Fibronectin." Arch. Biochem. Biophys.286. 337-345 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ruiliang Lu: "Purification and Characterization of a Membrane Bound Tyrosine-O-Sulfate-Binding Protein from Bovine Liver." Arch. Biochem. Biophys.286. 481-487 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yuji Kishima: "Betalain Pigmentation in Petal of Portulaca is Preceded by a Dramatic Tyrosine Accumulation." J. Plant Physiol.137. 505-506 (1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] P. H. Prasantha Fernand: "Protein Tyrosine Sulfation in Animal Cells and Its Simulation in vitro in the Downstream Processing of Proteins." Proceeding of the Fourth Annual Meeting and International Symposium of Japanese Association For Animal Cell Technology.(1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ming-Cheh Liu: "Possible Involvement of Protein Tyrosine Sulfation in the Polarized Protein Sorting in Filter-Grown Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) Cells." Proceeding of the Fourth Annual Meeting and Inter national Symposium of Japanese Association For Animal Cell Technology.(1991)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ming-Cheh Liu: "Identification of a Putative Tyrosine-O-Sulfate Receptor and Its Presence in Complex Form with a Major Tyrosine-Sulfated Protein, the 80 KDa Glycoprotein, in Madin-Darby Canine Kidney Cells." J. Biol. Chem.(1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] P. H. Prasantha Fernando: "Isolation and Characterization of a Novel(Microsomal)Membrane-Bound Phenol Sulfotransferase from Bovine Liver." Biochem. Biophys. Res. Commun.(1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yoichi Sakakibara: "Purification and Characterization of Tyrosine-O-sulfate-binding Protein from Bovine Serum." Arch. Biochem. Biophys.(1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Masahito Suiko: "The Role of Tyrosine Sulfation in Protein : Activities of Several Sulfatases on Tyrosine Sulfated Protein and Related Compounds." J. Biochem.(1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Masahito Suiko: Japan Sci. Soc. Press, Tokyo. The Post-translational Modification of Proteins, 19-34 (1992)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より