| 研究課題/領域番号 |
01400001
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
藤伊 正 筑波大学, 生物科学系, 教授 (20011611)
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| 研究分担者 |
原 諭吉 東京医科歯科大学, 医学部, 助教授 (00092429)
佐藤 忍 筑波大学, 生物科学系, 講師 (70196236)
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| キーワード | ラフィド藻 / Na^+ーATPase / イオン輸送 / PCR法 |
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| 研究概要 |
海産ラフィド藻ヘテロシグマアカシオcDNAからポリメラ-ゼチェインリアクション法(PCR)で増幅したアカシオATPase遺伝子の一部をプロ-ブとしてλgt11で作製したアカシオcDNAライブラリ-をスクリ-ニングし、約20万プラ-クから4つのポジティブプラ-クを得た。これらのクロ-ンは、制限酵素地図から2種のクロ-ンが2つずつ混合しているため、それぞれの長い方をサブクロ-ニングし、M13ファ-ジとABI社のDNAシ-クエンサ-を用いて2つのクロ-ンの配列を決定した。アミノ酸への変換を行い、2つのクロ-ンが共に膜上のイオン輸送に関わるATPaseの保存配列を持つことが明らかとなった。他種生物と比較したところ、それぞれが原生動物L__ー.<donovani>___ーのH^+ーATPaseと約60%、高等植物、酵母のH^+ーATPaseと40%〜50%の相同性を示したが、高等植物は20%〜30%の相同性しか示さなかった。これは輸送するイオン種よりも"進化的な近縁"と、それぞれのATPase分子の配列とが相関していることを示唆している。単離した2つのクロ-ンの相同性は、約70%であったが、完全長のcDNAではなかったため、2つのクロ-ンをプロ-ブに、アカシオ細胞の細胞周期でのそれぞれのATPaseの発現をノ-ザンハイブリダイゼ-ションで検討したところ、12時間明期12時間暗期で培養した細胞では、どちらのクロ-ンも明期10時間で強く発現していた。この時期の細胞から以前と同様にλgt11のcDNAライブラリ-を作製し、1つのクロ-ンの5'端をプロ-ブにスクリ-ニングを行ったところ16個のクロ-ンを得た。λgt11のア-ムとクロ-ン内部の配列をDNAシンセサイザ-で合成し、PCR法を使って調べ、ほぼ全長cDNAを得ることが出来た。
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