血管内皮由来の血管収縮ペプチド、エンドセリンの薬理学的生物学的研究

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01440022
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 眞崎 知生 筑波大学, 基礎医学系, 教授 (60009991)
• 研究分担者: 柳沢 正史 筑波大学, 基礎医学系, 講師 (20202369) ; 後藤 勝年 筑波大学, 基礎医学系, 教授 (30012660)
• キーワード: エンドセリン / 血管収縮 / エンドセリン受容体 / 細胞内遊離カルシュウム

研究概要

2種のヒト・エンドセリン受容体からキメラ受容体を作成し,その構造活性相関を解析した。これら受容体には、共に細胞内外に各3コのル-プがあるが、これに相当するcDNAの適当な位置に、siteーdirected mutagenesisにより共通の制限酵素部位を導入し、ここを接続点としてキメラ受容体cDNAを作成した。native及びキメラ受容体cDNAを、哺乳類発現ベクタ-に組み込み、DEAEーDextran法によりCOS細胞に一過性に発現させた。そして、ラジオリガンド結合実験及び、リガンド刺激による細胞内カルシウム上昇を蛍光色素であるFuraー2を用いて測定した。すべてのキメラ受容体は、エンドセリン受容体としての最低限の構造は保っていた。ETー3のK_D値のETー1のそれに対する非を検討した。nativeのET_Bでは,何者の比は1.0であった。ET_Bの構造を基本とし、N末端細胞外部分から3番目の膜貫通部分までをETAの構造に置換してもETー3のK_D値に有意な変化は認めなかった。ETー3のK_D値のETー1のそれに対する比を検討した。nativeのET_Bでは、3番目の膜貫通部分までをET_Aの構造に置換してもETー3のK_D値に有意な変化は認めなかった。さらに、4番目までの置換でK_D値は1桁落ち、5番目まで置換するとさらに1桁落ち、ほぼnativeのET_Aと同等になった。6番目、7番目までの置換でも結果に大きな違いは認めなかった。逆にC末端細胞内部部分から、7番目の膜貫通部分以降をET_Aで置換してみたところ、ETー3のK_D値は、約1桁落ちた。したがって、ET_B受容体のETー3に対する高親和性には、4番目から7番目の膜貫通部分までが関与していると考えられた。また、細胞内カルシウム上昇のEC_<50>前記とほぼ同様の傾向を示した。

研究成果

• [文献書誌] A.Saito: "Endothelins:vasoconstrictor effects and localization in canine cerebral arteris" Br.J.Pharmacology. 103. 1129-1135 (1991)
• [文献書誌] T.Sakurai: "cDNA cloning,sequence analysis and tissue distribtuion of rat preproendothelinー1 mRNA" Biochem.Biophys.Res.Commun.175. 44-47 (1991)
• [文献書誌] T.Sawamura: "Phosphoramidon inhibits the intracellular conversion of big endothelinー1 to endothelinー1 in cultured endothelial cells" Biochem.Biophys.Res.Commun.174. 779-784 (1991)
• [文献書誌] Y.Tomobe: "Mechanism of altered sensivity to endothelinー1 between aortic smooth muscles of spontaneously hypertensive and WistarーKyoto rats" J.Pharmacol.Exp.Ther.257. 555-561 (1991)
• [文献書誌] A.Sakamoto: "Cloning and functional expression of human cDNA for the ET_B endothelin receptor" Biochem.Biophys.Res.Commun.178. 656-663 (1991)
• [文献書誌] T.Ishikawa: "Characteristics of binding of endothelinー1 and endothelinー3 to rat hearts:Developmental changes in mechanical responses and receptor subtypes" Circ.Res.49. 918-926 (1991)
• [文献書誌] T.Masaki: "J.Cardiovascul.Pharmacol." Raven Press, 4 (1991)
• [文献書誌] T.Masaki: "Circulation" American Heart Association, 6 (1991)