カルモデュリン依存性蛋白質燐酸化酵素IIの構造と機能およびその生理作用

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01440023
• 研究機関: 旭川医科大学
• 研究代表者: 藤澤 仁 旭川医科大学, 医学部, 教授 (10027039)
• 研究分担者: 木谷 隆子 旭川医科大学, 医学部, 教務職員 (70101417) ; 加藤 剛志 旭川医科大学, 医学部, 助手 (60194833) ; 飛松 孝正 旭川医科大学, 医学部, 助手 (30188768) ; 亀下 勇 旭川医科大学, 医学部, 助教授 (60127941)
• キーワード: カルモデュリン依存性蛋白質燐酸化酵素 / 中枢神経機能 / カルシウムイオン / 蛋白質燐酸化 / 自己燐酸化 / アイソザイム / シエプス後膜主要蛋白質(PSD) / 分子生物学

研究概要

カルモデュリン依存性蛋白質燐酸化酵素II(キナ-ゼII)は、カルシウムイオンによる生体機能の調節、特に中枢神経系における神経機能の調節に代心的な役割を果していることが推定されているが、その調節機構の詳細は明らかになっていない。我々はキナ-ゼIIの構造と機能の関係を明らかにして、その生理的役割を追究するために、蛋白質レベルおよび遺伝子レベルでの研究に着手した。
キナ-ゼIIをSDS存在下にゲル電気泳動を行なってサブユニツトに解離した後、ゲルを塩酸グアニジンとツィ-ンで処理すると酵素サブユットの活性が回復するので、この性質を利用してサブユニットそれぞれの自己燐酸化活性あるいは基質蛋白質の燐酸化活性をゲル上でオ-トラジオグラフィ-によって分別定量する方法を開発した。本法によってサブユニット各々の蛋白量と活性との比較が可能となり、キナ-ゼIIの蛋白質レベルでの解析に大いに役立つことが期待される。
キナ-ゼIIにはalpha、beta、gammaのアイソフォ-ムが存在することをすでに報告しているが、さらに新しいアイソフォ-ムdeltaを見出しそのcDNA配列を決定した。各アイソフォ-ムの一次構組を相互に比較検討し、酵素ポリペプチド内のATP結合部位、カルモデュリン結合部位、自己燐酸化部位、触媒領域等を推定した。さらにalpha、beta、gamma、deltaそれぞれのcDNAをプロ-ブとしてRNAブロットを行ない、各アイソフォ-ムのmRNAの組織分布を調べた。gamma、deltaアイソフォ-ムは中枢および末梢の各組織に普遍的に存在するのに対してalpha、betaアイソフォ-ムは脳に遍在していることが明らかになり、その臓器特異性が明らかになった。肝臓のmRNAはgammaプロ-ブと僅かに反応しただけでalpha、beta、deltaとの反応性を認められなかった。蛋白質レベルの研究から肝臓にはキナ-ゼIIのアイソザイムが存在することが知られており、その関連も興味深い。

研究成果

• [文献書誌] 飛松孝正: "Tissue Specific Expression of Four Types of Rat CalmodulinーDependent Protein Kinase II mRNAs" J.Biol.Chem.264. 17907-17912 (1989)
• [文献書誌] 今井嘉紀: "Modulation of Tryptophan Hydroxylase Activity by Phospholipids:stimulation followed by inactivation" J.Neurochem.53. 1293-1299 (1989)
• [文献書誌] 加藤剛志: "カルモジュリン依存性プロティンキナ-ゼIIのタ-ゲットプロティン" 実験医学. 7. 1085-1090 (1989)
• [文献書誌] 奥野幸子: "Regulation of human tyrosine hydroxylase activity:Effects of cyclic AMPーdependent protein kinase,calmodulonーdependent protein kinase II,and polyanion" FEBS Lett.253. 52-54 (1989)
• [文献書誌] 木谷隆子: "Purification and Characterization of Antizyme Inhibitor of Ornithine Decarboxylase from Rat Liver" Biochim.Biophys.Acta. 991. 44-49 (1989)
• [文献書誌] 中田裕康: "5′ーNーEthercarboxamide〔^3H〕Adenosine Binding Sites of Mouse Mastocytoma P815 Cell Membranes" J.Biochem.105. 888-893 (1989)
• [文献書誌] 藤澤仁: "Calmodulinーdependent Protein Kinase II" BioEssays. 12. 27-29 (1990)
• [文献書誌] 亀下勇: "A Sensitive Method for Detection of Calmodulinーdependent Protein Kinase II Activity in Sodium Dodecyl Sulfatepolyacrylamide Gel" Anal.Biochem.183. 139-143 (1989)
• [文献書誌] 奥野幸子: "カテコ-ルアミン生合成の調節" 蛋白質、核酸、酵素. 35. 630-637 (1990)
• [文献書誌] 大森行雄: "Intracellurar Localization of Tyrosine Hydroxylase Immunoreactivity in the Rat Adrenal Chromaffin and Pheochrocytoma Cells" Acta Anatomica. 136. 1-8 (1989)
• [文献書誌] 大森行雄: "TyrosineーHydroxylaseーImmunoreactive Nerve Fibers in the Separated Capsule of the Rat Adrenal Gland" Acta Anatomica. 136. 49-54 (1989)
• [文献書誌] 藤澤仁: "カルモデュリンによる蛋白質燐酸化反応" 病態生理. 9. 15-21 (1990)
• [文献書誌] 藤澤,仁: "Bioinformatics(Eds.by O.Hatase,J.H.Wang)" Elsevier Science Publishers B.V., 8 (1989)
• [文献書誌] 佐藤広和: "Bioinformatics(EdS.by O.Hatase,J.H.Wang)" Elsevier Science Publishers B.V., 4 (1989)