動物個体内の組織細胞への遺伝子注入法の開発とそれに基づく疾病治療の基礎的研究

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01440087
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 中西 真人 大阪大学細胞工学センター, 助手 (10172355)
• 研究分担者: 金田 安史 大阪大学細胞工学センター, 助手 (10177537) ; 米田 悦啓 大阪大学細胞工学センター, 助手 (80191667)
• キーワード: HVJ(Sendai virus) / 遺伝子導入 / RNAベクタ- / 人工染色体 / リポソ-ム

研究概要

初年度で遺伝子を組織細胞に効率よく導入するための基礎的な条件を決定することができたので、今年度は導入した遺伝情報の安定化に向けて2つの方向から研究を進めた。
<1.センダイウイルス(HVJ)の遺伝子発現機構を使ったRNAベクタ-の開発。>___ー初年度は大腸菌ガラクトシダ-ゼ遺伝子の発現を試みたが動物細胞にもこの酵素が存在するため結果が明快ではなく、外来遺伝子を確実に発現している細胞だけが生き残れるように大腸菌のHYGB耐性遺伝子の発現を試みた。まずこの遺伝子をHVJゲノムの3'および5'末端の構造と接続し試験管内でネガティブ鎖RNAを合成した。次にこのRNAをHVJが持続感染している細胞に導入したところハイグロマイシンB耐性となった細胞株が得られた。この形質は安定であり、細胞質に導入した遺伝子由来のmRNAが検出できた。このことからHVJの遺伝子発現機構を用いて安定に遺伝子発現ができるシステムが可能であることが確認できた。現在このアプロ-チをさらに進めて組換えRNAウイルスの作成を検討中である。
<2.染色体の構造を使った人工染色体ベクタ-の開発。>___ー初年度の結果から、発現を安定化するためには、DNAそのものに安定化に必要な一次構造が必要であるという結論に達した。そこで既に直鎖DNAで安定な人工染色体の存在が知られている出芽酵母の例を参考にして、動物細胞で安定に存在できる人工染色体の開発を始めた。まず染色体末端のテロメアの構造と動物細胞での選択マ-カ-(HYGB耐性遺伝子およびBS耐性遺伝子)、および得られた直鎖DNAを出芽酵母で解析するために必要な遺伝子を結合したMYACベクタ-を作成した。現在ヒトゲノム遺伝子断片にこのベクタ-を結合してHVJの融合能を利用してマウス細胞に導入し、安定な人工染色体を含むクロ-ンの単離を検討中である。

研究成果

• [文献書誌] Kato,K.,Nakanishi,M.,Kaneda,Y.,Uchida,T.and Okada,Y.: "Expression of Hepatitis B Virus Surface Antigen in Adult Rat Liver" The Jounal of Biological Chemistry. 266. 3361-3364 (1991)
• [文献書誌] Imamoto,N.,Matuoka,Y.,Semba,T.,Okada,Y.,Uchida,T.and Yoneda,Y.: "A Protein Recognized by Antibodies to AspーAspーAspーGluーAsp Shows Specific Binding Activity to Heterogenous Nuclear Transport Signals" The Jounal of Biological Chemistry. 265. 16504-16508 (1990)
• [文献書誌] Kim,J.,Adachi,T.,Yoneda,Y.and Okada,Y.: "Fusion of MadinーDarby canine kidney cells by HVJ(Sendai virus):absence of direct association of virus particles with the site of membrane fusion." European Jounal of Cell Biology. 51. 128-134 (1990)
• [文献書誌] 中西 真人,他(共著): "先端の医生物学とバイオサイエンス" 中山書店, 480 (1990)