| 研究概要 |
1.本酵素アイソザイムの分離とその諸性質の比較および構造上の違いについて;マウス各組織についてアイソザイムの存在を検討し、基質特異性,分子量および抗原性の異なる3種のアイソザイムを見出し、これらをI型,II型およびIII型とした。II型は表皮と毛のうを除く多くの組織に、I型は表皮と子宮(II型も存在)に、そしてIII型は表皮と毛のうに存在した。ゲル濾過法による分子量はI型は54KD,II型とIII型は10KDであった。表皮よりIII型を単一にまで精製した。SDSーPAGEによる分子量はII型(81KD)よりやや小さく76KD、II型と部分的な共通抗原性を示した。また他の型に比しプロタミンに高い活性を示した。
2.本酵素ゲノムDNAクロ-ンの分離と構造解析;マウス肝臓よりのゲノムを7種の制限酵素で消化後、cDNA3'末端をプロ-ブとするハイブリダイゼ-ションを行った結果,単一コピ-遺伝子であると判断された。次に、マウスゲノムライブラリ-からcDNA(1292b〜2296b)をプロ-ブとしてスクリ-ニングし、cDNA上のC末側の翻訳領域と非翻訳領域に相当する12.5Kbクロ-ン(GPAD6)を単離した。さらにcDNAの1b〜1146bをプロ-ブとして13.4Kbのクロ-ン(GPAD1)を得た。これはcDNAの5'末端とプロモ-タ領域を含むと推定された。GPAD1とGPAD6を合せてcDNAの65%をカバ-していた。
3.同酵素発現プラスミドの構築と大腸菌での発現;本酵素mRNAの全長をカバ-する2つのλファ-ジクロ-ンλPAD1およびλPAD24よりインサ-ト部分をEcoRIで切り出し、Bluesript SKプラスミドに組み込み、3'-非翻訳領域を削除後,大腸菌発現ベクタ-pKK223ー3に組み込み、本酵素の大腸菌発現プラスミドpKK PAD1を構築した。この同酵素発現プラスミドは強力なtacプロモ-タ-を持ち、1PTGにより制御される。現在、大腸菌内での発現を試みている。
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