| 研究概要 |
新しい機能をもつ蛋白質を設計するためには構造がよく研究されている蛋白質を改変し、構造と活性の変化を調べることが必要である。我々は酵素阻害剤の設計を目指して、その構造がよく調べられているプロテア-ゼ・インヒビタ-SSI(Streptomyces Subtilisin Inhibitor)を遺伝子工学的に改変し活性の変化を調べた。まずSSIの作用部位の中心であるP1部位Met73を他の19種類のアミノ酸に変換した。その結果、Lys,Arg変異体はトリプシンを、Tyr,Phe,Trp 変異体はキモトリプシンを阻害するようになることがわかった。また基質特異性の広いズブチリシンに対しては上記の変異体は野生型同様、強い阻害活性を示したが、ズブチリシンの基質特異性から外れるGlu, Ile, Pro などをP1部位に導入すると阻害活性は低下した。すなわち、プロテイ-ゼの基質特異性とインヒビタ-の阻害活性の間には高い相関関係があることが示された。さらに、P1部位がLys であるSSIのP4部位Met70 をGly に変換するとトリプシンに対する阻害活性が、またP1部位がGly であるSSIのP4部位をPhe に変換するとズブチリシンに対する阻害活性が上昇することがわかり、インヒビタ-の反応部位近傍のアミノ酸残基を目的のプロテア-ゼの基質結合部位に合致するように変換することにより、強いインヒビタ-を設計することが可能であることが示された。一方、SSIの反応部位近傍に存在するジスルフィド結合を遺伝子工学的に取り除くと、ズブチリシンとのインキュベ-ション時間の経過と共に阻害活性が低下していくという現象(一時阻害)が観察され、本来はインヒビタ-であるSSIが分解されることが明らかになった。すなわち、SSIがプロテア-ゼ・インヒビタ-として機能するためには、ジスルフィド結合などにより反応部位近傍が固い構造をとることが必要であることが示された。
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