蛍光標識化によるOー配糖体糖鎖の高感度な構造解析法の開発

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01470147
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 長谷 純宏 大阪大学, 理学部, 教授 (80028232)
• キーワード: Oー配糖体 / 糖蛋白質 / ピリジルアミノ化 / 糖鎖 / ヒドラジン分解 / 蛍光標識 / HPLC / 2次元マップ

研究概要

セリンまたはトレオニンに結合している糖鎖(Oー配糖体)はムチンやプロテオグリカン以外にも血液凝固因子、免疫グロブリン、ホルモン等やグリコホリンの様な膜蛋白質中に見出され、組織中に広く存在することが明らかとなった。又Oー配糖体糖鎖はその非還元末端が癌関連抗原、血液等生理活性糖鎖残基となっている。従ってOー配糖体糖鎖を高感度に切りだし、分離し、構造解析することは生理活性の研究や臨床検査において重要である。本研究はピリジルアミノ化法をOー配糖体にも応用し、高感度で検出や分離が出来るだけでなく、二次元マップの作成も含めた糖鎖構造解析法の開発を目的とした。このため、糖蛋白質よりヒドラジン分解を用いOー配糖体糖鎖を切りだし、得られた還元末端をピリジルアミノ化する方法をとった。この反応での収率を向上させる条件を検討するため次の実験を行なった。1)予備実験としてOー配糖体糖鎖をもつフェツインを選び、上記方法でピリジルアミノ化Oー配糖体糖鎖を得ることが出来たので、この方法でピリジルアミノ化Oー配糖体糖鎖を調製出来ることが判明した。2)フェツインをプロナ-ゼ消化することよりOー配糖体糖鎖を含む糖ペプチドを大量に調製した。3)フェツインよりヒドラジン分解を用いてOー配糖体糖鎖を調製し、その還元末端をピリジルアミノ化した化合物を調製した。その構造をメチル化分析等を行ない、ガスクロマトグラフー質量分析計で決定した。4)ピリジルアミノ化Oー配糖体糖鎖のHPLCでの溶出位置を求めた。これらの量の分かっているOー配糖体糖ペプチドとピリジルアミノ化Oー配糖体糖鎖を用いてヒドラジンの分解による糖鎖の切り出しの条件を検討し、求めた最良の条件下で種々のピリジルアミノ化Oー配糖体糖鎖を調製する予定である。

研究成果

• [文献書誌] S.Yamamoto: "Structures of the Sugar Chains of Interferon-γ Produced by Human Myelomonocyte Cell Line HBL-38" J.Biochem.105. 547-555 (1989)
• [文献書誌] S.Yamamoto: "Studies of the Sugar Chains of Interferon-γ from Human Peripheral-Blood Lymphocytes" J.Biochem.105. 1034-1039 (1989)
• [文献書誌] H.Nishimura: "Identification of a Disaccharide(Xyl-Glc)and a Trisaccharide(Xyl_2-Glc)O-Glycosidically Linked to a Serine Residue in the First Epidermal Growth Factor-like Domain of Human Factors VII and IX and Protein Z and Bovine Z" J.Biol.Chem.264. 20320-20325 (1989)
• [文献書誌] S.Hase: "The Structure of(Xylose)_2Glucose-O-Serine 53 Found in the First Epidermal Growth Factor-like Domain of Bovine Blood Clotting Factor IX" J.Biol.Chem.265. 1858-1861 (1990)
• [文献書誌] S.Hase: "Estimation of Elution Times on Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography of Pyridylamino Derivatives of Sugar Chains from Glycoproteins" Anal.Biochem.184. 135-138 (1990)
• [文献書誌] H.Oku: "Separation of Oligomannose-Type Sugar Chains Having One to Five Mannose Residues by HPLC as Their Pyridylamino Derivatives" Anal.Biochem.(1990)
• [文献書誌] 長谷純宏: "新生化学実験講座第3巻糖質工" 東京化学同人,
• [文献書誌] 長谷純宏: "(糖関連化学物質・糖鎖微量分析)研究室で役に立つ新しい試薬" 医学書院, 2 (1989)