蛍光標識化によるOー配糖体糖鎖の高感度な構造解析法の開発

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01470147
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 長谷 純宏 大阪大学, 理学部, 教授 (80028232)
• キーワード: Oー配糖体 / 糖蛋白質 / ピリジルアミノ化 / 糖鎖 / ヒドラジン分解 / 蛍光標識 / HPLC

研究概要

セリン又はトレオニンに結合している糖鎖(Oー配糖体)はムチン、プロテオグリカン、免疫グロブリン、ホルモン等広く存在しているものである。従来よりOー配糖体糖鎖の構造研究にはアルカリーボロヒドリドによる切り出しや酵素を用いている。一方我々は糖鎖の還元末端を蛍光標識して高感度に分析する蛍光標識法を開発しNー配糖体糖鎖に応用して来た。この方法をOー配糖体糖鎖にも応用することを本研究で試みた。
アルカリーボロヒドリド法では切り出した糖鎖の還元末端が糖アルコ-ルとなり蛍光標識されない。このため新しい切り出し方法の開発が必要となる。このため前年度で調製した糖ペプチド、蛍光標識Oー配糖体、そのHPLCでの溶出条件等を用いてOー配糖体糖鎖の切り出し方法を検討した。種々の切り出し試薬を検討した所、無水ヒドラジンが最も良い結果を与えた。無水ヒドラジンを用い糖ペプチドより糖鎖を切り出し、Nーアセチル化し、蛍光標識して、HPLCで定量して、切り出しの条件を検討したところ、糖ペプチドから蛍光標識糖鎖までの収率は最良で50%であった。コントロ-ル実験の結果、Nーアセチル化の反応や蛍光標識での収率を補正すると、Oー配糖体糖鎖の収率は80%であった。この方法を天然のOー配糖体を持つ糖蛋白質に応用したところ、期待した結果が得られた。

研究成果

• [文献書誌] A.Kondo: "Improved Method for Fluorescence Labeling of Sugar Chains with Sialic Acid Residues" Agric.Biol.Chem.54. 2169-2170 (1990)
• [文献書誌] J.Suzuki: "Analysis by Highーperformance Anionーexchange Chromatography of Component Sugars as Their Fluorescent Pyridylamino Derivatives" Agric.Biol.Chem.55. 283-284 (1991)
• [文献書誌] S.Hase: "The Structure of (Xylose)_2GlucoseーOーSerine 53 Found in the First Epidermal Growth Factorーlike Domain of Bovine Clotting Factor IX" J.Biol.Chem.265. 1858-1861 (1990)
• [文献書誌] S.Hase: "Estimation of Elution Times on ReverseーPhase HighーPerformance Liquid Chromatography of Pyridylamino Derivatives of Sugar Chains from Glycoproteins" Anal.Biochem.184. 135-138 (1990)
• [文献書誌] H.Oku: "Separation of OligomannoseーType Sugar Chains Having One to Five Mannose Residues by HighーPerformance Liquid Chromatography as Their Pyridylamino Derivatives" Anal.Biochem.185. 331-334 (1990)
• [文献書誌] T.Mega: "Measurement of LectinーSugar Binding Constants by Microequilibrium Dialysis Coupled with High Performance Liquid Chromatography" J.Biochem.in press.
• [文献書誌] 長谷 純宏: "新生化学実験講座第3巻糖質I" 東京化学同人, 24 (1990)