ホスホリパ-ゼA_2の高機能触媒作用に必要な構造的要素の解析

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01470149
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 大野 素徳 九州大学, 理学部, 教授 (30038434)
• 研究分担者: 下東 康幸 九州大学, 理学部, 助手 (00211293) ; 脇 道典 九州大学, 理学部, 助手 (30037212) ; 青柳 東彦 九州大学, 理学部, 助教授 (80037267)
• キーワード: 奄美ハブ毒 / ホスホリパ-ゼA_2 / アイソザイム / 遺伝子工学 / cDNA / ゲノムDNA

研究概要

奄美ハブ毒からの高活性型Aspー49ーホスホリパ-ゼA_2(PLA_2)及びこれの1〜2%の活性しかもたない低活性型Lysー49ーPLA_22種のアミノ酸配列を決定した。両活性型PLA_2は122アミノ酸残基を含み、約60%の相同性を示し、そして14個のハ-フシスチン残基の位置は同じである。このPLA_2アイソザイム系は、PLA_2の触媒機能や生理機能発現の構造要因を解明する至適な系となる。本研究は、遺伝子工学的手法により両活性型PLA_2の変異タンパク質を合成し、構造と機能の関係を調べることを目的とする。(1)本研究の一環として、Aspー49ーPLA_2の活性部位His47ーAsp99の相互作用をメチルPーニトロベンゼンスルホネ-トによるpH依存的Hisー47のメチル化反応より調べ、Hisー47のプロトン化が触媒反応の遷移状態を安定化する要因と推定した。(2)高活性型及び低活性型の3種のPLA_2のcDNAを調製した。高活性型酵素cDNAの塩基配列からのアミノ酸配列は、既報のタンパク質からの配列と一部で一致しなかったが、タンパク質配列の再検討から、cDNAからの配列が正しいことがわかった。またPLーXと呼ばれる酵素に類似したAspー49ーPLA_2のcDNAの塩基配列も決定した。これらのcDNAを用いて、大腸菌を宿主とするタンパク質の発現研究を行っているが、まだ成功に至っていない。研究を続行中である。(3)2種の高活性型Aspー49ーPLA_2及び2種の低活性型Lysー49ーPLA_2のcDNAの塩基配列を比較すると、翻訳領域よりも5'ー及び3'ー非翻訳領域において相同性が遥かに高いという新知見を得た。非翻訳領域の発現調節への役割を調べる一つの手段として、ゲノムDNAの解析を行っている。9個のクロ-ンをとり、その一つについて塩基配列を解析中である。(4)タンパク質の発現に成功していないが、ハブ毒PLA_2アイソザイムの興味ある遺伝子構造の発見は今後の研究の展開に資するものである。関連する雑誌論文は5報である。

研究成果

• [文献書誌] T.Kohzuma,N.Oda,H.Kihara,M.Ohno: "Investigation of an Active Site HistidineーAspartate Couple in <Trimeresurus>___ー <flavoviridis>___ー Phospholipase A_2" Journal of Biochemistry. 106. 1054-1058 (1989)
• [文献書誌] K.Yoshizumi,S.ーY.Liu,T.Miyata,S.Saita,M.Ohno,S.Iwanaga,H.Kihara: "Purification and Amino Acid sequence of Basic Protein I,a Lysineー49ーPhospholipase A_2 with Low Activity,from the Venom of <Trimeresurus>___ー <flavoviridis>___ー (Habu Snake)" Toxicon. 28. 43-54 (1990)
• [文献書誌] Y.Shinoda,A.Shouji,A.Suzuki,T.Ashida,H.Kihara,M.Ohno: "Preliminary Crystallographic Study of Phospholipase A_2 from the Venom of <Trimeresurus>___ー <flavoviridis>___ー (Habu Snake)" Journal of Biochemistry. 107. 84-86 (1990)
• [文献書誌] S.ーY.Liu,K.Yoshizumi,N.Oda,M.Ohno,F.Tokunaga,S.Iwanaga,H.Kihara: "Purification and Amino Acid Sequence of Basic Protein II,a Lysineー49ーPhospholipase A_2 with Low Activity,from <Trimeresurus>___ー <flavoviridis>___ー Venom" Journal of Biochemistry. 107. 400-408 (1990)
• [文献書誌] N.Oda,T.Ogawa,M.Ohno,H.Sasaki,Y.Sakai,H.Kihara: "Cloning and Sequence Analysis of cDNA for <Trimeresurus>___ー <flavoviridis>___ー Phospholipase A_2,and Consequent Revision of the Amino Acid Sequence" Journal of Biochemistry. 108. 816-821 (1990)