放線菌の生産するコレステロ-ル転換酵素系の遺伝生化学的究明とその応用

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01480036
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 室岡 義勝 広島大学, 工学部, 教授 (60029882)
• 研究分担者: 山下 光雄 広島大学, 工学部, 助手 (40220347) ; 小埜 和久 広島大学, 工学部, 助教授 (10144883)
• キーワード: 放線菌 / コレステロ-ル転換酵素系 / シトクロ-ムP450 / 遺伝生化学

研究概要

コレステロ-ルは、動物体重の2%を占める代表的ステロ-ルで、各種ホルモンの前駆体となる重要な脂質である。コレステロ-ルの臨床検査には、もっぱらコレステロ-ル酸化酵素を用いた方法が使用されている。本研究は、放線菌の生産するコレステロ-ル酸化酵素遺伝子の放線菌内へのクロ-ニングと、放線菌宿主ーベクタ-系を用いた酵素生産性の向上研究に始まり、遺伝子の構造解析による、いくつかの興味ある発見と、将来への可能性を持った展望の基に、計画実施された。
本研究過程において、放線菌のコレステロ-ル酸化酵素の全遺伝子配列を決定した。成熟タンパク質は、504コのアミノ酸をコ-ドし、分子量54,913と推定された。コンピュ-タ-グラフィクにより、FAD結合サイトや、コレステロ-ル結合サイト等、を解析した。本酵素遺伝子の上流に、チトクロ-ムP450類似遺伝子の存在を発見した。チトクロ-ムP450は、コレステロ-ルの胆汁酸への異化初期反応に関与するほか、ステロイドの水酸化等の多種多様なオキシダ-ゼ反応を触媒することが知られている。この遺伝子とコレステロ-ル酸化酵素遺伝子が、オペロンを形成していること、および少なくとも3つの転写産物がある事を証明した。
さらに、コレステロ-ル転換系の一連の遺伝子を、guided genomic walking法を独自に開発し、約30kbのDNAをクロ-ニングした。さらに、上記のクロ-ン化遺伝子を利用して、コレステロ-ル酸化酵素を大量に分泌発現させる事に成功した。この事により、下の生産菌より70倍の生産性の向上を見た。

研究成果

• [文献書誌] Tomoyuki Ishizaki: "Nucleotide sequence of the gene for cholesterol oxidase from a streptomyces sp." Jouranal of Bacteriology. 171. 596-601 (1989)
• [文献書誌] Yoshikatsu Murooka: "A new operon involved in a sterol metabolism in Streptomyces sp." Actinomycetology. 3. 89-94 (1989)
• [文献書誌] Masami Horii: "An operon containing the gene for cholesterol oxidase and a cytochrome Pー450ーlike protein from a Streptomyces sp." Jouranal of Bacteriology. 172. 3644-3653 (1990)
• [文献書誌] Istv^^'an Moln^^'ar: "“Guided genomic walking",a systematic approach to cloning intermediateーsized restriction fragments extending outside the boundaries of known sequences"
• [文献書誌] Istv^^'an Molna^^'ar: "Secretory overproduction of the Streptomyces cholesterol oxidase by Streptomyces lividans with a recombinant multiーcopy vector"
• [文献書誌] Yoshikatsu Murooka: "Biotechnology Advances 分担執筆" Pergamon Press Plc.,Oxford,UK, 29 (1990)
• [文献書誌] Yoshikatsu Murooka: "Fermentation Technologies:Industrial Applications 分担執筆" Elsvier Applied Sciences,London,UK, 6 (1990)