遺伝子工学的方法の導入によるGABA_A及びGABA_B受容体の構造と機能の解析

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01480143
• 研究機関: 京都府立医科大学
• 研究代表者: 栗山 欣弥 京都府立医科大学, 医学部, 教授 (20079734)
• 研究分担者: 廣内 雅明 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (70181196) ; 田口 淳一 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (50188132)
• キーワード: GABA_A受容体 / GABA_B受容体 / cDNAクロ-ニング / αサブユニット / βサブユニット / クロライドイオンチャネル / 機能発現 / mRNA

研究概要

ヒト脳及びウシ脳のGABA_A及びGABA_B受容体の構造と機能について分子薬理学的及び遺伝子工学的検討を行い、下記の成績を得た。
1.ヒト脳内GABA_A受容体αサブユニットに対してcDNAクロ-ニングを行い、塩基配列から全アミノ酸配列を決定し、456個のアミノ酸からなることを確認した。またその配列はウシ脳のGABA_A受容体αサブユニットの場合と相同性が高いことを見出した。
2.上記のヒト脳のcDNAをプロ-ブとしてpoly(A)^+RNAのノ-ザンブロット解析を行ったところ、単一のmRNA(4.5Kb)の存在が確認された。
3.ヒト脳の遺伝子DNAをEcoRI又はHindIIIで処理しサウザンブロット解析を行ったところ、2〜3個のhybridization帯の存在が確認できた。これらの結果はヒト脳GABA_A受容体αサブユニットはエキソンーイントロン構造を有することを示唆する。
4.ヒト脳GABA_A受容体のαサブユニットは膜貫通領域と考えられる4箇所の疎水性領域を有し、クロライドイオンチャネルを構成していると考えられる。
5.GABA_A受容体αサブユニットのcDNAより、SP6RNAポリメラ-ゼ系を用いてmRNAを得、このmRNAをアフリカツメガエルの卵母細胞の発現系に適用してcDNAからのGABA_A受容体の機能発現を試みたところ、明らかにGABA依存性Cl^-流入とこれに伴なう抑制性後シナプス電位の出現が認められた。
6.GABA_B受容体のcDNAクロ-ニングを行う前段階として、バクロフェンーエポキシ活性化セファロ-ス6Bによるアフィニティ-カラムクロマトグラフィ-を開発し、ウシ脳からGABA_B受容体の約2,800倍の精製に成功した。目下これを用いてcDNAクロ-ニング中である。

研究成果

• [文献書誌] 栗山欣弥: "GABAレセプタ-" 代謝. 26巻増刊. 208-214 (1989)
• [文献書誌] M.Hirouchi,R.Kuwano,T.Katagiri,Y.Takahashi,K.Kuriyama: "Neucleotide and deduced amino acid sequences of GABA_A receptor α-subunit from human brain" Neurochemistry International. 15. 33-38 (1989)
• [文献書誌] Y.Ohmori,M.Hirouchi,J.Taguchi,K.Kuriyama: "Functional coupling of GABA_B receptor with calcium ion channel and GTP-binding protein and its alteration following solubilization of GABA_B receptor" Journal of Neurochemistry. 54. 80-85 (1990)
• [文献書誌] Y.Ohmori,K.Kuriyama: "Negative coupling of GABA_B receptor with phosphatidylinositol turnover in the brain" Neurochemistry International. 15. 359-363 (1989)
• [文献書誌] M.Nishikawa,K.Kuriyama: "Functional coupling of cerebral GABA_B receptor with adenylate cyclase system:Effect of phaclofen" Neurochemistry International. 14. 85-90 (1989)
• [文献書誌] J.Taguchi,T.Kuriyama,Y.Ohmori,K.Kuriyama: "Immunohistochemical studies on distribution of GABA_A receptor complex in the rat brain using antibody against purified GABA_A receptor" Brain Research. 483. 395-401 (1989)