| 研究概要 |
アスパラギン酸アミノ基転移酵素には細胞質型(cAspAT)とミトコンドリア型(mAspAT)の2つのアイソザイムが存在するが、個々のアイソザイムの機能分担を解析する目的で、遺伝子標目組み込み法により、マウス細胞質型遺伝子の挿入変異導入による破壊を試みた。また、cAspATは生体エネルギ-獲得に必須な酵素であり、遺伝子の完全な破壊は細胞死に至る可能性も考えられたので、挿入変異導入用ベクタ-と同時に、酵素機能の部分的な破壊を目的とした点変異導入用ベクタ-の作製を試みた。
1)挿入変異導入用ベクタ-の作製:マウスcAspAT遺伝子の第2イントロンから第6エクソンにわたる約5kbのDNA断片を用い、第3エクソン内にMCーneo遺伝子を挿入した。3'末端には、非相同組換えによる組み込み細胞株を除くために、MCーtk遺伝子を連結させた。我々は、これと同じ選別マ-カ-を持つ置換ベクタ-とマウスES細胞を用いてトランスサイレチン遺伝子の標的破壊を行い、標的組み込み株の選別法の有効性を確認し、単離した変異ES株を用いてのキメラマウス作製及び子窓マウスへの変異の伝達に成功した。
2)点変異導入用ベクタ-の作製:標的組み込みと同一分子内での相同組換えを利用したHastyらの方法(Nature,350,243ー246,1991)に基づいてベクタ-を試作した。cAspATのTyr70をPheに変えた変異酵素では酵素活性が約15%に減少することが見いだされているので、まずマウスcAspAT遺伝子の第1イントロンの一部、目的のTyr70をコ-ドスる第2エクソン、第2イントロンの一部を含むDNA断片を調整し、部位特異的変異導入法によりTyr70→Phe変異を作製した。このDNA断片をプラスミドpGEM1に結合させ、選別用マ-カ-として、MCーneo遺伝子、その下流にMCーtk遺伝子を導入したものを置換ベクタ-とした。
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