ヒト中鎖アシルCoA脱水素酵素cDNAの動物細胞における発現

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01480159
• 研究機関: (財)応用生化学研究所
• 研究代表者: 八木 國夫 応用生化学研究所, 所長 (00022749)
• 研究分担者: 稲垣 泰介 応用生化学研究所, 主任研究員 (60211059)
• キーワード: 中鎖アシルCoA脱水素酵素 / 酵素活性欠損 / 遺伝子異常 / 培養線維芽細胞 / cDNA / mRNA / タンパク合成 / 分子遺伝学

研究概要

中鎖アシルCoA脱水素酵素はミトコンドリアのマトリックスに存在し、脂肪酸のβ酸化の最初の反応を触媒するβ酸化系の律速酵素で、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とする。本酵素の異常により発症する先天性代謝異常の症例が現在までに85例以上報告されているが、本研究ではこの患者における酵素の異常部位の探索ならびに異常症の遺伝子治療の開発を最終目標とし、その基礎的成績を得ることを目的とした。本年度においては、先ずヒト胎盤cDNAライブラリ-より本酵素のcDNAのクロ-ニングをさきに単離に成功したラッテ肝臓由来のcDNAをプロ-ブとして行った。その結果、1263ヌクレオチドの翻訳領域、64および686ヌクレオチドの5,および3,非翻訳領域の全鎖長を有するヒト臓器由来の本酵素のcDNAを得ることができた。ついでこのcDNAおよび本酵素に対する抗体を用いて、本酵素活性欠損患者2症例(MV,AH)の培養線維芽細胞について分子レベルの検討を行った。イムノブロットによる解析により、MVでは本酵素タンパクが検出されず、AHでは正常にタンパクと同一分子量の不活性なタンパクが合成されることが判明した。本酵素のmRNAレベルについて、ヒト胎盤由来cDNAのHapIIーHindIIIフラグメントをプロ-ブとしてRNAブロット解析を行ったところ、MV、AHいずれの細胞のレベルも正常人由来細胞のものと同レベルであった。以上の結果より、患者MVとAHでは本酵素活性欠損の様式が異なっており、MVではmRNAの5'ー非翻訳領域または開始領域に変異が生じているか、あるいは合成された前駆体タンパクが異常で細胞内で直ちに分解されるものと考えられた。一方、AHでは翻訳領域で点変異が生じており、不活性な酵素タンパクを産生するものと考えられた。この欠損細胞での本酵素cDNAの発現系を組立てる為にいくつかのプラスミドを構築することができた。

研究成果

• [文献書誌] Inagaki,T.,Ohishi,N.,Tsukagoshi,N.,Udaka,S.,Ghisla,S.,and Yagi,K.: "Structually different rat liver medium-chain acyl CoA dehydro-genases directed by the complementary DNAs differing in the 5'ーregion" Biochimica et Biophysica Acta. (1990)
• [文献書誌] Inagaki,T.,Ohishi,N.,Bachman,C.,Ghisla,S.,Tsukagoshi,N.,Udaka,S.,and Yagi,K.: "Immunochemical and molecular analysis of medium-chain acyl CoA dehydrogenase dificiency" Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition. (1990)