| 研究課題/領域番号 |
01480261
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| 研究種目 |
一般研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
小児科学
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| 研究機関 | 札幌医科大学 |
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研究代表者 |
千葉 峻三 札幌医科大学, 医学部, 教授 (50045374)
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| 研究分担者 |
鈴木 信寛 札幌医科大学, 医学部, 助手 (50216420)
吉田 幸一 札幌医科大学, がん研究所, 講師 (60117653)
山中 樹 札幌医科大学, 医学部, 助教授 (70045508)
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| 研究期間 (年度) |
1989 – 1990
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| キーワード | ヒト・サイトメガロウイルス / DNA検出法 / ポリメラ-ゼ連鎖反応 / PCR法 / RTーPCR法 |
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| 研究概要 |
ヒト・サイトメガロウイルス(HCMV)の潜伏感染、再活性化、発症の諸段階をHCMV遺伝子の発現状態から診断することを目的して、Polymerase chain reaction (PCR)法とDNAハイブリダイゼ-ションを用いてHCMVのDNAならびにmRNA検出法を開発した。
1.HCMVの前初期(immediate early;IE)遺伝子と後期(late;L)遺伝子をコ-ドするプライマ-をそれぞれ作成し、それぞれの遺伝子断片を増幅するPCR法を確立した。本法で増幅されたDNA断片は各種ヒト細胞DNAや他のヘルペス科ウイルスDNAとhomologyを有さず、本法のHCMV特異性が証明された。また、検出感度を検討した結果、、10^<ー3>〜10^<ー4>pgのHCMV・DNAの検出が可能であった。
2.L遺伝子プライマ-を用いたPCR法により尿や母乳などの臨床材料からのHCMV・DNAの検出を試みた結果細胞培養法により短時間でかつ高感度にHCMVを検出出来ることが証明された。また、従来ウイルス分離が困難であった凍結保存材料の使用も可能であった。
3.HCMVの再活性化を捕捉する手段としてCombined reverse transcriptionーPCR法(RTーPCR法)を開発した。すなわち、IE遺伝子の発現によるmRNAを検出するために検体から抽出したRNAにreverse transcriptase を作用させてcDNAを合成し、IE遺伝子プライマ-を用いてPCR法を行った。HCMVをMRCー5細胞に感染させたあとRTーPCR法を用いて経時的にmRNAの検出を試みたところ、感染後24、48、72時間までは検出できたが96時間以降は検出できなかった。
4.結論として、IE、L両遺伝子のプライマ-を併用したPCRとRTーPCRを用いることにより、HCMVによる latent infection,reactivation,productive infection の諸段階を遺伝子レベルで診断することが可能になった。
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