| 研究課題/領域番号 |
01480489
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
大塚 栄子 北海道大学, 薬学部, 教授 (80028836)
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| 研究分担者 |
紙谷 浩之 北海道大学, 薬学部, 教務職員 (10204629)
岩井 成憲 北海道大学, 薬学部, 助手 (10168544)
井上 英夫 北海道大学, 薬学部, 助手 (80088856)
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| キーワード | オリゴリボヌクレオチド / リボザイム / 酵素活性 / CDスペクトル |
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| 研究概要 |
近年、酵素活性を有するRNAが相次いで発見されており、リボザイムと総称されている。これらの中で最小の分子はある種のウイルスのサテライトRNAやウイロイド等で発見された自己切断RNAであり、その切断反応には「ハンマ-ヘッド」と呼ばれる構造を形成する必要があると考えられている。本研究の代表者らはすでに、化学合成したRNA断片(オリゴリボヌクレオチド)を用いて、ハンマ-ヘッド型リボザイム中の切断に必要なヌクレオチドの解析を行っている。本研究はこの切断反応の機構を解明することを目的とし、本年度はkinetic parameterの導出とcircular dichroism(CD)の測定を行った。
これまでの研究では2本の21量体から成る酵素-基質複合体を用いていたが、本研究では合成が容易で切断効率の向上が期待できる3本の鎖(2本が酵素で1本が基質)に分けた複合体を用いることとし、各鎖を合成してこの型の複合体で切断反応が起こること、および切断部位の2′-水酸基がメチル化されたものでは切断されないことを確認した。このような酵素と基質を用いてkinetic parameterを求めると、Km=0.53μM、Vmax=0.015μM・min^<-1>、Kcat=0.03min^<-1>となった。
CDスペクトルの測定は、切断部位の2′-水酸基がメチル化された切断されない基質アナログを用いて行った。測定温度を変化させると32℃と37℃の間で265nmにおけるθ値が最も大きく変化したが、この結果はメチル化されていない基質の切断速度が32℃で最大になることと一致し、この温度以上では切断に必要な高次構造が形成できなくなると考えられる。現在、切断反応に必要な3次元構造について、さらに詳細な解析を行っている。
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