多形核白血球における活性酸素産生とその制御機構

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01480492
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 石橋 貞彦 広島大学, 医学部, 教授 (90012616)
• 研究分担者: 岡村 直樹 広島大学, 医学部, 助手 (30144827)
• キーワード: 活性酸素 / ス-パ-オキシドアニオン / 多形核白血球 / NADPHオキシダ-ゼ / プロテインキナ-ゼC / 細胞膜 / 酵素制御

研究概要

従来に引き続きモルモット多形核白血球を用い、O^-_2産生にはたらくNADPHオキシダ-ゼの活性化に関連してプロテインキナ-ゼC(PKC)によりリン酸化される46K蛋白に関する検討を進めた。この蛋白はリン酸化前は細胞質に検出されるが、リン酸化後は細胞膜画分に検出されるので、PKCによりリン酸化はこの移行にかかわっているとみなされるが、高濃度のアラキドン酸やSDSで処理すると、46K蛋白リン酸化の促進なしにO^-_2産生が認められたことからPKCの関与しないO^-_2産生機構が考えられた。この間主にヒト白血球を用いた海外での研究から、通常は細胞質に存在し刺激に伴って細胞膜に移行してO^-_2産生にあたる細胞質因子(cytosolic factor)と名付けられた65〜67Kや46〜48K等の蛋白が報告され、後者と我々の発見した46K蛋白との異同性を種々の観点から検討した結果、同種のものと判断するに至った。前記のアラキドン酸等によってもこれら蛋白の細胞質から細胞膜への移行が認められているので、PKCによるリン酸基の導入は蛋白に負電荷を与えることによって働いている可能性が考えられた。さらに、白血球をO^-_2産生刺激した後きわめて低濃度のグルタルアルデヒドで蛋白架橋処理し、活性複合体形成における構成蛋白間反応を検討した。
次のステップとして、白血球を予め低張処理するとPKC activatorのみならずアラキドン酸やSDSによるO^-_2産生が著しく増大することを見いだし、上述の活性NADPHオキシダ-ゼ複合体形成に先立って作動しているとみられる前提段階構成反応(primingとも呼ばれる)を解析した。cytochalasin等の細胞骨格作用物質による処理もO^-_2産生に対して低張処理と似た効果を示した。一方蛍光色素を用いて膜電位変化を測定し、priming状態に刺激が加わってO^-_2が産生されるに至るような条件下では細胞膜において脱分極的変化が進行することを認めた。これらの結果は、primingと膜の脱分極状態との関連を示すように思われる。

研究成果

• [文献書誌] Masaki Ozawa: "Synergism between Protein Kinase C Activatior and Fatty Acids in Stimulating Superoxide Anion Production in Guinea Pig Polymorphonuclear Leukocytes" Arch.Biochem.Biophys.273. 491-496 (1989)
• [文献書誌] Toshiaki Ohtsuka: "Stimulatory Effects of a Short Chain Phosphatidate on Superoxide Anion Production in Guinea Pig Polymorphonuclear Leukocytes" J.Biochem.106. 259-263 (1989)
• [文献書誌] Toshiaki Ohtsuka: "Synergism between PlateletーActivating Factor and Diacylglycerol in the Induction of Superoxide Anion Production in Guine Pig Polymorphonuclear LeuKocytes" Arch.Biochem.Biophys.279. 21-24 (1990)
• [文献書誌] Teruaki Katayama: "Effect of Glutaraldehyde on NADPH Oxidase System of Guinea Pig Polymorphonuclear Leukocytes" Arch.Biochem.Biophys.278. 431-436 (1990)
• [文献書誌] Toshiaki Ohtsuka: "Involvement of Membrane Charges in Constituting the Active Form of NADPH Oxidase in Guinea Pig Polymorphonuclear Leukocytes" Arch.Biochem.Biophys.280. 74-79 (1990)
• [文献書誌] Kyoko Wakamura: "Mechanism for the inhibitory Effect of a SelenoーOrganic Compound,Ebselen,and Its Analogues on Superoxide Anion Production in Guinea Pig Polymorphonuclear Leukocytes" J.PharmacobioーDyn.13. 421-425 (1990)
• [文献書誌] Toshiaki Ohtsuka: "Translocation of the 46kDa Protein(s)in Response to Activation of NADPH Oxidase in Guinea Pig Polymorphonuclear Leukocytes" J.Bioochem.108. 169-174 (1990)
• [文献書誌] Toshiaki Ohtsuka: "A Diacylglycerol Kinase Inhibitor,R 59 022,Potentiates Superoxide Anion Production and 46ーkDa Protein Phosphorylation in Guinea Pig Polymorphonuclear Leukocytes" J.Biol.Chem.265. 15418-15423 (1990)
• [文献書誌] 石橋 貞彦: "好中球の活性酸素生成と蛋白質リン酸化反応" J.Act.Oxyg.FreeRad.1. 171-182 (1990)
• [文献書誌] Masanori Hiura: "Stimulation of Superoxide Anion Production in Guinea Pig Polymorphonuclear Leukocytes by Hypotonic Conditions in Combiantion with Protein Kinase C Activatiors" Arch.Biochem.Biophys.291. 31-37 (1991)
• [文献書誌] Sadahiko Ishibashi: "Mechanism for production of active oxygen metabolites on plasma membranes of neutrophil" Membrane. 16. 131-140 (1991)
• [文献書誌] Sadahiko Ishibashi(共同執筆): "Physiology and Pharmacology of transmembrane signalling" Excerpta Medica, 404 (1989)
• [文献書誌] 石橋 貞彦(共同執筆): "白血球と生体防御" 講談社, 272 (1990)