H^+-ATPaseおよびH^+/K^+ATPaseによるイオン輸送機構の解析

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01480528
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 二井 將光 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (50012646)
• 研究分担者: 下村 正二 大阪大学, 産業科学研究所, 助手 (90116046) ; 森山 芳則 大阪大学, 産業科学研究所, 助手 (10150658) ; 前田 正知 大阪大学, 産業科学研究所, 助教授 (80190297)
• キーワード: H^+-ATPase / H^+ / K^+ATPase / ATP合成 / 胃酸分泌

研究概要

ATPの加水分解と共役してH^+を輸送する2つの膜酵素(H^+-ATPaseとH^+/K^+ATPase)に注目した。H^+-ATPaseは膜電位差とpH差の形成、およびATP合成に重要であり、H^+/K^+ATPaseは胃壁細胞に局在し、胃酸分泌酵素として知られている。これらの酵素のATP結合部位、H^+輸送路、ATP合成/分解とイオン輸送の共役機構、遺伝子の発現調節等に関し、詳細な解析を行っている。
以下に本年度の成果を要約する。1. 大腸菌H^+-ATPaseのaサブユニットに変異を導入し、解析を行い、Arg-21a残基がH^+輸送路の一部であることを示した。2. H^+-ATPaseの活性中心の一部を形成しているβサブユニットのGly-149-Thr-156の部分に変異を導入し、解析を行った。同時にこの部分の2次構造を推定し、構造の変換と酵素活性の変化を対応させた。3. H^+-ATPaseのγサブユニットのカルボキシル末端側に変異を導入し、検討した結果、このサブユニットがH^+の輸送を調節しているゲ-トであることを示した。4. シロイヌナズナのγサブユニットの遺伝子をクロ-ン化し、植物に特異的な挿入配列があることを示した。5. メタン細菌のH^+-ATPaseの遺伝子をクロ-ン化し、塩基配列を決定した。その結果、このH^+-ATPaseは液胞型のATPaseであることが明らかになった。6. ブタ胃壁H^+/K^+ATPaseの活性中心を形成しているLys-497残基を同定した。7. ヒトのH^+/K^+ATPaseの遺伝子DNAをクロ-ン化し、塩基配列を決定した。この遺伝子の読枠の5′側上流に本酵素の組織特異的発現に関与していると考えられる塩基配列を同定した。8. ブタH^+/K^+ATPaseのcDNAをcos細胞に於て発現することができた。
以上、研究計画は順調に進行した。

研究成果

• [文献書誌] Satoshi Soga: "Mutational replacements of conserved amino acid residues in α subunit change catalysis of Escherichia coli F_1-ATPase." Archives of Biochemistry and Biophysics. 268. 643-648 (1989)
• [文献書誌] Masamitsu Futai: "ATP synthase(H^+-ATPase):Results by combined biochemical and molecular biological approaches." Annual Review of Biochemistry. 58. 111-136 (1989)
• [文献書誌] Shigehiko Tamura: "Pig gastric(H^++K^+)-ATPase:Lys-497 conserved in cation transporting ATPases is modified with pyridoxal 5′-phosphate." The Journal of Biological Chemistry. 264. 8580-8584 (1989)
• [文献書誌] Ken-ichi Inatomi: "Amino acid sequence of the α and β subunits of Methanosarcina barkeri ATPase deduced from cloned genes:Similarity to subunits of eukaryotic vacuolar and F_oF_1-ATPases." The Journal of Biological Chemistry. 264. 10954-10959 (1989)
• [文献書誌] Ken-ichi Inatomi: "Dicyclohexylcarbodiimide-binding protein is a subunit of the Methanosarcina barkeri ATPase complex." Biochemical and Biophysical Research Communications. 162. 1585-1590 (1989)
• [文献書誌] Seiji Eya: "Overproduction of truncated subunit a of H^+-ATPase causes growth inhibition of Escherichia coli." Journal of Bacteriology. 171. 6853-6858 (1989)
• [文献書誌] Atsuko Iwamoto: "H^+-ATPase γ subunit from Escherichia coli:Role of the conserved carboxyl terminal region." The Journal of Biological Chemistry. 265. (1990)
• [文献書誌] Hironori Hanada: "Uni-site catalysis by Escherichia coli F_1-ATPase with different numbers of bound nucleotides." FEBS Letters. 257. 465-467 (1989)
• [文献書誌] Yasuo Sugiyama: "Isolation of a gene that encodes a new retinal protein,archaerhodopsin,from Halobacterium sp.aus-1." The Journal of Biological Chemistry. 264. 20859-20862 (1989)
• [文献書誌] Masamitsu Futai: "Anion transport protein of the red blood cell membrane" Elsevier Science Publishers,B.V., 179-189 (1989)