RecA蛋白質ドメインの結晶化

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01480539
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 小川 智子 大阪大学, 理学部, 講師 (80028208)
• 研究分担者: 小川 英行 大阪大学, 理学部, 教授 (70028207)
• キーワード: E.coli recA遺伝子 / P.aeruginosa recA遺伝子 / recAキメラ遺伝子 / recBrecCsbcA変異株 / 遺伝子組換え / SOS機能の誘導 / RecA蛋白質の機能ドメイン / キメラ遺伝子形成の新方法

研究概要

大腸菌のRecA蛋白質は、遺伝的組換えとDNA障害修復に関与するSOS機能の誘導をおこなう多機能蛋白質である。352個のアミノ酸からなる平均的な大きさの蛋白質が、どのような仕組みで多機能を発揮するかを理解するためには、その構造と機能との関係を理解する必要がある。我々は可能な遺伝的手法を駆使してRecA蛋白質の機能ドメイン構造の解明を行なってきた。しかしこれまでの方法では扱える数に大きな制約があった。本研究ではキメラ遺伝子を極めて容易に、多種類に、しかも狙った場所で取る方法を開発して、研究を飛躍的に開展させることができた。即ち、大腸菌のrecA遺伝子とP.aeruginosaのrecA遺伝子は構造的にも機能的にも、非常に良く似ている。この二つの遺伝子をプラスミドベクタ-上に同方向にタンデムに配置し、両遺伝子間には制限酵素部位を持つリンカ-を挿入する。このプラスミドをリンカ-部位で切断して線状構造にした後、recBrecCsbcA変異を持つ大腸菌株を形質転換する。この形質転換体から回収されるプラスミドは、ほとんどすべてがrecA遺伝子間で組換えをして環状構造になったもので、キメラrecA遺伝子を形成している。また両遺伝子間のオ-バ-ラップ領域を限定すると、キメラ遺伝子の境界をその領域内に限ることができる。以上のようにして得たキメラ遺伝子の境界では塩基の余分な付加や欠失は一切起行らない。この方法で多種多様なキメラ遺伝子を形成しその機能を解析して次のような結果を得た。N端が大腸菌のRecAの時には、境界がアミノ酸167番目と250番目の間にあるとそのキメラは野生型の機能を持たない。それに対してN端がP.aeruginosaの場合には、その前の116と167の間が境界になると、野生型の機能をまったく持たなくなる。しかし境界が58から116の時には組換えは正常だがSOS機能が欠損した今までにない表現形のものとなった。この方法で研究の画期的な進展が期待できる。

研究成果

• [文献書誌] A.Higashitani,S.Tabata,T.Ogawa,H.Ogawa,M.Shibata and Y.Hotta: "ATPーindependent strand transfer protein from murine spermatocytes,spermatids,and spermatozoa" Exp.Cell Res. 186. 317-323 (1990)
• [文献書誌] M.Kojima,M.Suzuki,T.Morita,T.Ogawa,H.Ogawa and M.Tada: "Interaction of RecA protein with pBR322 DNA modified by Nーhydroxyー2ーacetylaminofluorene and 4ーhydroxyaminoquinoline 1ーoxide" Nucleic Acids Res.18. 2707-2714 (1990)
• [文献書誌] H.Ogawa and T.Ogawa: "Regulation in repressor inactivation by RecA protein" Adv.Biophysi.26. 33-49 (1990)
• [文献書誌] 小川 智子・小川 英行: "大腸菌SOS応答反応の分子機構" 蛋白質 核酸 酵素. 35. 893-904 (1990)