RecA蛋白質ドメインの結晶化

1991 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01480539
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 小川 智子 大阪大学, 理学部, 講師 (80028208)
• 研究分担者: 小川 英行 大阪大学, 理学部, 教授 (70028207)
• キーワード: 大腸菌RecA遺伝子 / 緑膿菌RecA遺伝子 / キメラ蛋白質 / RecA蛋白質のドメイン構造 / RecA蛋白質のオリゴメリゼ-ション / 遺伝的組換え / SOS応答反応

研究概要

本研究はDNAの遺伝的組換えと、細胞のDNA生じた傷害の修復に必要な機能の発現に中心的役割を果す、大腸菌RecA蛋白質の構造と機能の関連を明らかにし、これらの機構を分子レベルで解明することを目指して行なわれたものである。これらの反応にはRecA蛋白質がssDNAとATPとで形成した複合体が重要な働きをしているが、RecA蛋白質とATPやssDNAとの結合部位、また重合体形成やリプレッサ-の認識部位等についての理解は殆ど得られていない。これまで我々は、RecA遺伝子の変異株の分離とその位置の決定、それら変異の遺伝子内抑制変異の分離、RecA遺伝子部分欠質変異株を作製し、それらの遺伝的解析や変異蛋白質の生化学的解析を行なってきた。本研究は更に、蛋白質のドメインの解析を深めるために、機能的に非常に高い相同性を持ち、蛋白質のアミノ酸配列に適当な違いのある大腸菌と緑膿菌のrecA遺伝子を用いて一連のキメラを作成し、その結合部位と遺伝的性質の関連を調べ、次の結果を得た。(1)蛋白質の機能に協同的に働く部位を4箇所検出した。それらは蛋白質の構造上ル-プに存在し、活性蛋白質のグロ-バルな構造を決める上で重要な役割を担っている。(2)RecA蛋白質はアミノ酸番号30から260番目で一つの大きなドメインを形成し、この領域はRecA蛋白質の機能に対して中心的な役目を担っている。特に塩基アデニンとの結合部位や、ATPaseに必要なMgイオンとの結合部位を含む。一方、60から100番目にATPのガンマ-位の燐酸との結合部位がある。(3)オリゴマ-形成能を欠失した変異の単離は初めてであり、それらは30ー53と102ー113の領域に存在する。(4)これら変異RecA蛋白質のオリゴマ-形成にはATPとの結合による蛋白質の構造変化が重要な役目を果している。(5)1992年2月にATP非存在下で結晶化したRecA蛋白質の構造変化が発表された。その構造はRecA蛋白質の30から260番目の領域が一つの大きなドメインを形成していること示し、また、我々のこれまでの解析から予測したオリゴマ-形成に関与する領域は、まさに結晶構造と一致していた。欠失変異、遺伝子内抑制変異とキメラ遺伝子の解析が蛋白質の構造を充分に予測できることが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] A.Higashitani,S.Tabata,T.Ogawa,H.Ogawa,M.Shibata and Y.Hotta,: "ATPーindependent strand transfer protein from murin spermatocytes,spermatids,and spermatozoa." Exp.Cell Res.,. 186. 317-323 (1990)
• [文献書誌] M.Kojima,M.Suzuki,T.Morita,T.Ogawa,H.Ogawa and M.Tada: "Interaction of RecA protein with pBR322 DNA modified by Nーhydroxyー2ーacetylaminofluorene and 4ーhydroxyaminoquinoline 1ーoxide." Nucleic Acids Res.,. 18. 2707-2714 (1990)
• [文献書誌] H.Ogawa and T.Ogawa,: "Regulation in repressor inactivation by RecA protein." Adv.Biophysi.,. 26. 33-49 (1990)
• [文献書誌] Horii,T.,Ozawa,N.,Ogawa,T.and Ogawa,H.: "Inhibitory effects of Nー and Cーterminal truncated Escherichia coli recA gene products on functions of the wideーtype recA gene." J.Mol.Biol.,. 223. 105-114 (1992)
• [文献書誌] Tateishi,S.Horii,T.,Ogawa,T.and Ogawa,H.: "Cーterminal truncated Escherichia coli RecA protein RecA5327 has enhanced binding affinities to singleー and doubleーstranded DNAs" J.Mol.Biol.223. 115-129 (1992)
• [文献書誌] Leem,S.and Ogawa,H.: "The MER4 gene encodes a novel proteinkinase homologue required for meiotic recombination in Saccharomyces cerevisiae." Nucleic acids Res.20. 449-457 (1992)
• [文献書誌] Shinohara,A.,Ogawa,H.and Ogawa,T.: "Rad51 protein involved in repair and recombination in Saccharomycesa cerevisiae is a RecAーlike protein." Cell. 59. (1992)
• [文献書誌] Ogawa,T.,Shinohara,A.,Ogawa,H.and Tomizawa,J.: "Functional structures of the RecA protein found by chimera analysis." J.Mol.Biol.(1992)
• [文献書誌] Ajimura,M.,Leem,S.and Ogawa,H: "Identification of new genes required for meiotic recombination(MRE)" Genetics. (1992)
• [文献書誌] Shigeru Kuwahara,Tadahiko Yoshima,JienーNong Fong and Tomoko Ogawa,: "Cloning of RAD55 gene and primary analysis on its gene product in Saccharomyces cerevisiae." in preparation.
• [文献書誌] Shigeru Kuwahara and Tomoko Ogawa: "The novel phenotypes of meiotic recombination and synaptonemal complex formation in the rad55 nul mutant." in preparation.
• [文献書誌] 小川 智子,小川 英行: "大腸菌SOS応答反応の分子機構" 蛋白質核酸酵素. 35. 893-904 (1990)
• [文献書誌] 小川 智子,小川 英行: "シリ-ズ分子生物学の進歩2.「DNA複製とその調節」″DNA組換え機構:RecA蛋白質の機能と構造″分担" 日本分子生物学会編 丸善, 247-276 (1989)
• [文献書誌] 小川 智子: "新生化学実験講座2.核酸I:分離精製″密度勾配遠心法″分担" 日本生化学会編、東京化学同人, 53-80 (1991)