急速凍結・電顕法を用いた生体分子のミリ秒時間分解能における動態分析

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01480541
• 研究機関: 岡崎国立共同研究機構
• 研究代表者: 月田 承一郎 岡崎国立共同研究機構, 生理学研究所, 教授 (50155347)
• 研究分担者: 月田 早智子 岡崎国立共同研究機構, 生理学研究所, 助手 (00188517)
• キーワード: ケ-ジド化合物 / 電子顕微鏡 / ミオシン / 急速凍結 / 液体ヘリウム / ATP

研究概要

昨年度においてケ-ジド化合物を用いた凍結システムが完成したので、本年度は、このシステムの評価も兼ねて、2種類の実験を行った。第一の実験は、ATP非存在下でアクチンフィラメントにフルデコレ-ションしたミオシンサブフラグメント1(S1)が、ATP濃度の急激な上昇に伴い、どのようにしてアクチンフィラメントから離れていくかを追跡しようというものである。ケ-ジドATP存在下でS1のアクチンフィラメントへの結合様式があまり変わらないのを確認したのち、このようなサンプルに光を照射し、その後の変化をディ-プエッチングレプリカ像のコマ取り写真として解析した。その結果、S1が光照射後15ミリ秒あたりからアクチンフィラメントから離脱しはじめ、その結合様式を大きく変えていく様子を初めて捉えることに成功した。得られた像が持つ意味を正確に理解するためには、まだ、多くの実験を進めなくてはならないと思われるが、少なくともこの実験によって、我々の開発したシステムにより、滑り運動系における蛋白質相互作用をきわめて高時間分解能の電子顕微鏡像として追跡できるという確信が得られた。第二の実験は、無負荷の状態で最高速度で収縮している瞬間の単離筋原線維を急速凍結し、そのクロスブリッジの様子を観察しようとするものである。この収縮は極めて短時間で終わってしまうため、ケ-ジド化合物のシステムを用いる必要がある。現在、光照射後最大収縮速度で短縮中の筋原線維の急速凍結に成功し、そのディ-プエッチングレプリカ像を得つつある。このような方法により得られる像が筋収縮の分子機構を考えるうえで重要な情報を与えてくれるものと期待出来る。以上、我々が開発したケ-ジド化合物を利用した急速凍結システムは、ほぼ完成しており、このシステムがきわめて強力な研究手段となりうることが証明された。

研究成果

• [文献書誌] Tsukita,Sh.: "The undercoat of adherens junctions:A key specialized structure in organogenesis and carcinogenesis." Cell Struct.Funct.15. 7-12 (1990)
• [文献書誌] Nishikawa,S.: "Localization of adherens junction proteins along the possible sliding interface between secretory ameloblasts of the rat incisor." Cell Struct.Funct.15. 245-250 (1990)
• [文献書誌] Sato,N.: "Radixin,a barbedーendーcapping actinーmodulating protein,is concentrated at the cleavage furrow during cytokinesis." J.Cell Biol.
• [文献書誌] Muto,E.: "Doubleーrowed organization of inner dynein arms in Chlamydomonas flagella revealed by tiltーseries thinーsection electron microscopy." J.Cell Sci.
• [文献書誌] Tsukita,Sa: "Specific protoーoncogenic tyrosine kinases of src family are enriched in cellーtoーcell adherens junctions where the level of tyrosine phosphorylation is elevated." J.Cell Biol.