| 研究課題/領域番号 |
01490017
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
佐藤 清隆 広島大学, 生物生産学部, 助教授 (80034479)
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| 研究分担者 |
江坂 宗春 広島大学, 生物生産学部, 助教授 (70151975)
堀 貫治 広島大学, 生物生産学部, 助教授 (50116662)
永松 康徳 広島大学, 生物生産学部, 助教授 (30144893)
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| キーワード | 有用たんぱく質 / たんぱく質の結晶化 / lepidopteran toxin / Ado Hcy hydrolase / メチル基転移反応酵素 |
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| 研究概要 |
本研究課題の有用たんぱく質結晶化の対象分子として、lepidopteran toxinのT-fragmentとNative proteinを始めにとりあげ、培養・精製・結晶化を試みた。トリプシン分解したT-fragmentを、たんぱく質濃度を約4mg/mlで、ハンギングドロップ法による蒸気平衡原理にもとづいて結晶化を試みる一方,透析法も併用した。析出剤として、Nacl、(NH_4)_2SO_4NaBrを用い、PH範囲は6〜7である。いずれの条件においても、アモルファス状の沈澱となり、結晶化は生じなかった。そこで、nativeなproteinを、タンパク質濃度が2mg/ml、蒸気拡散法により、析出剤をNaBr、(NH_4)_2SO_4として、PHを6〜8の範囲で結晶化を試みたが成功しなかった。いずれも、飽和濃度以上でアモルファス化しやすいので、今後、エフェクタ-などで疏水性相互作用を減じるなどの工夫が必要と考えられる。なお、lepidopteran toxinは、そのクロ-ン化が成功したので、今後組み換えDNA法により大腸菌による大量生産が可能となった。
当初の計画に加え、バクテリア産生酵素である、Ado Hcy hydrolaseの結晶化を試み、10μm以上の単結晶育成条件を見出した。この酵素はメチル基転移反応に働く酵素で、また立体構造は未解明である。PH7.5,タンパク質濃度を4.3〜25mg/mlとして、(NH_4)_2SO_4を析出剤として4℃の蒸気平衡法により単結晶が育成する。PHを大きくするにつれ、結晶化の範囲が狭くなり、低タンパク質濃度では結晶化しにくくなるので、溶解度が増加したためである。また、Ado Hcy hydrolaseでは、いったんアモルファス化した後に、結晶化が促されるので、比較的結晶化は容易である。
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