化学増幅を利用した酵素電極の高感度化に関する研究

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01540491
• 研究機関: 大阪府立大学
• 研究代表者: 八尾 俊男 大阪府立大学, 工学部, 講師 (50081310)
• キーワード: 高感度酵素電極システム / 固定化酵素リアクタ- / 化学増幅 / 基質リサイクリング反応

研究概要

前年度に行った酵素リサイクリング反応に基づいた化学増幅型電極は、通常の酵素電極の測定感度を100ー1000倍上げることに成功したが、2、3の問題点もあった。それは電極の長期安定性に劣ることと、増幅率が基質の低濃度で高く、高濃度で低いこにより、電極応答と基質濃度との間に良好な直線関係が認められないことであっる。これは酵素電極では、固定化できる酵素量に限りがあるので、僅かな活性の低下がセンサ-の安定性に関わってくることと、酵素リサイクリング反応を定量的に行わせることが難しいからである。そこで、比較的多量の酵素を固定できる酵素リアクタ-を増幅素子として用いた酵素電極システムについて、更に検討を行った。
アミノプロピルCPGにグルタルアルデヒドを橋架け剤として、第一の酵素の生成物が第二の酵素の基質となる様な組合せの酵素を同時固定化したミニ酵素リアクタ-を作製した。Lー乳酸とピリビン酸の測定には乳酸酸化酵素/乳酸脱水素酵素固定化リアクタ-をリン酸の測定にはアルカリ性ホスファタ-ゼ/ヌクレオシドホスホリラ-ゼ/キサンチン酸化酵素リアクタ-を、Lーグリタミン酸の測定にはグルタミン酸酸化酵素/グルタミック-ピリビックトランスアミナ-ゼリアクタ-を、NAD補酵素の測定にはグルコ-スー6ーリン酸脱水素酵素/乳酸脱水素酵素/乳酸酸化酵素リアクタ-を用い、電気化学検出器を備えたフロ-インジェクション流路に組み入れた。試料ゾ-ンがリアクタ-を通過する際に、効率の良いリサイクリング反応が起こると共に、多量の過酸化水素を生成するので、これを電流検出することで、数十〜数百倍増幅された応答が得られた。本法は、酵素の高選択的触媒機能を有効利用したもので、特定の分析種をオンラインで増幅できることから、本酵素電極システムを、HPLCの高感度ポストカラム検出器として用いることもできた。

研究成果

• [文献書誌] 八尾 俊男: "固定化酵素/フロ-インジェクション分析法によるアデノシンミリン酸とグリコ-スー6ーリン酸の同時定量" J.Flow Ingection Anal. 6. 37-43 (1989)
• [文献書誌] Toshio YAO: "Amperometric Determination of Lactose in Human and Cow's Milk Using a FlowーInjection System with Some Immobilized Enzyme Reactors" EDlectroanalysis. 1. 413-416 (1989)
• [文献書誌] Toshio YAO: "FlowーInjection Analysis for LーGlutamate Using Immobilized LーGlutamate Oxidase;Comparison of an Enzyme Reactor and Enzyme Electrode" Analytica Chimica Acta. 231. 121-124 (1990)
• [文献書誌] Toshio YAO: "LーGlutamate Enzyme Electrode Involving Amplification by Substrate Recycling" Analytica Chimica Acta. 236. 437-440 (1990)
• [文献書誌] Toshio YAO: "Amperometric FlowーInjection Analysis of LーGlutamate Using an Immobilized Enzyme Reactor;Amplification by Substrate Recycling" Electroanalysis. 2. 563-566 (1990)
• [文献書誌] Tsohio YAO: "Development of a FIA System with Immobilized Enzymes for Specific PostーColumn Detection of Purine Bases and Their Nucleosides Separated by HPLC Column" Journal of Biotechnology. 14. 89-97 (1990)
• [文献書誌] Toshio YAO: "Amperometric FlowーInjection System with an Immobilized Enzyme Reactor for the Highly Selective Detection of Phosphate and OnーIine Amplification by Substrate Recycling" Analytica Chimica Acta. 238. 339-343 (1990)
• [文献書誌] Toshio YAO: "Highly Sensitive Determination of LーLactate and Pyruvate by Liquid chromatography and Amperometric Detection with Lactate Oxidase/Lactate Dehydrogenase Coimmobilized Reactor Involving Amplification by Substrate Recycling" Electroanalysis. 3. (1991)
• [文献書誌] Toshio YAO: "Highly Sensitive Detection of Nicotinamide Coenzymes by Use of an Immobilized Enzyme Reactor Involving Amplification by Substrate Recycling into an Amperometric Flow System" Analitica Chimica Acta. (1991)
• [文献書誌] R.D.Schmid: "Flow Injection Analysis(FIA)Based on Enzymes or Antibodies" VCH Publisher, (323)