| 研究課題/領域番号 |
01550683
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
高井 光男 北海道大学, 工学部, 助教授 (50002019)
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| 研究分担者 |
清水 祐一 北海道大学, 工学部, 助手 (80142694)
林 治助 北海道大学, 工学部, 教授 (10001182)
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| キーワード | 酢酸菌 / セルロ-ス / 生合成 / 遺伝子 / クロ-ニング / キメラプラスミド / シャトルベクタ- / 形質転換 |
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| 研究概要 |
酢酸菌Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO 3288が7種のプラスミドDNAを保有していることを確認し、分子サイズの大きなものからpFF1〜7とした。pFFプラスミドは種々の制限酵素切断部位をもつこと、比較的分子サイズが小さいこと、また酢酸菌由来であることからベクタ-として利用できると考えた。しかし、pFFプラスミドはベクタ-として必要な遺伝学的マ-カ-が不明なため、大腸菌プラスミドのアンピシリン耐性遺伝子をマ-カ-として利用することを考えた。酢酸菌プラスミドpFFと大腸菌プラスミドpUC18とを連結し、キメラプラスミドを作成した。これらのキメラプラスミドを大腸菌Escherichia coli JM109内に導入させ、回収して解析した。回収したキメラプラスミドをセルロ-ス産生酢酸菌ATCC 10245への導入を試み、そのうち最も効率のよかったpAcc2を実用的てシャトルベクタ-としてpUF106と再命名した。酢酸菌ATCC 10245から回収したpUF106が再び大腸菌JM109へ導入できることを確認した。このようにpUF106は酢酸菌-大腸菌間のシャトルベクタ-として機能した。
このベクタ-を用いて遺伝子クロ-ニングを行なうためには、高い形質転換効率(遺伝子導入効率)が必要である。当初の遺伝子導入法には、酢酸産生の酢酸菌に関して報告されている方法を用いたが、我々はセルロ-ス産生酢酸菌に適した方法を検討するため、この方法の種々の方法を変えてみた。コンピテント菌の調整溶液の塩化カルシウム濃度は0mMの場合が最も形質転換効率がよい。コンピテント菌とベクタ-の混合後に添加するポリエチレングリコ-ル(PEG)4,000の濃度は30%の場合がもっともよい。これらの条件ではベクタ-DNA 1μg当りの形質転換株の数が10^4個を越えており、この宿主-ベクタ-系は十分実用になると思われる。
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