| 研究課題/領域番号 |
01550683
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
高分子物性・高分子材料
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
高井 光男 北海道大学, 工学部, 助教授 (50002019)
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| 研究分担者 |
藤原 政司 北海道大学, 工学部, 助手 (30229075)
清水 祐一 北海道大学, 工学部, 助手 (80142694)
林 治助 北海道大学, 工学部, 教授 (10001182)
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| 研究期間 (年度) |
1989 – 1990
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| キーワード | 酢酸菌 / セルロ-ス / 生合成 / 遺伝子 / クロ-ニング / プラスミド / ベクタ- / 形貭転換 |
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| 研究概要 |
酢酸菌の産生するバクテリアセルロ-スは、工業材料として有望であるが生産コストの低減が課題である。我々は酢酸菌のセルロ-ス産生能を改善することを目的として、遺伝子組換え技術による育種改良を試みている。これまでに我々はセルロ-ス産生酢酸菌自身において遺伝子操作を可能とする宿主ーベクタ-系を開発した。今回は、実際にセルロ-ス生合成遺伝子のクロ-ニングを行う前に予備的にモデル実験を行った。モデル実験では、ショットガンクロ-ニング法によってセルロ-ス産生酢酸菌のもつロイシン合成遺伝子(βーイソプロピルマレ-ト デヒドロゲ-ゼ遺伝子)をクロ-ニングした。
ロイシン非要求性であるセルロ-ス産生酢酸菌(Acetobacter xylinum)ATCCー10245のト-タルDNAをMarmur法により分離精製し、回収した。これを制限酵素Bam HI,Sal I をそれぞれ単独に用いて断片化し、各断片をプラスミドベクタ-pUC18に連結した。ロイシン要求性である大腸菌(Escherichia coli)HB101,C600をHanahan法に従って処理しコンピテント菌を調製した。これからとト-タルDNA断片が挿入されているベクタ-を混合し導入させた。その中でロイシン非要求性に形質転換した株をM9最小培地(ロイシンを含まず)で選択した。
形質転換させた結果、Bam I 挿入ベクタ-を用いた大腸菌C600形質転換体の中からロイシン非要求性に転換している菌株が得られた。この菌が持っているプラスミドDNAは9.2kbのサイズでありベクタ-pUC18のサイズ(2.7kb)より大きかった。このプラスミドをpUL1と命名した。プラスミドpUL1を再びロイシン要求性の大腸菌C600に導入させたところ、大腸菌C600は非要求性に形質転換した。 したがって、このpUL1中に酢酸菌A.xylinum ATTCCー10245のロイシン合成遺伝子が含まれているといえる。次にpUL1の制限酵素切断地図を作成した。挿入した酢酸菌のDNA断片部分は6.5kbであり、この部分にロイシン合成遺伝子が存在する。さらにこの挿入部分上の位置を特定するため、pUL1を制限酵素HindIIIで小さな断片に切断し数種類の小型のベクタ-を作成した。大腸菌C600を形質転換させた結果、3.8kb(pUL1より小さなサイズ)のプラスミドを所有する形質転換が得られた。このプラスミドをpULH1とした。pULH1の制限酵素切断地図から、pULH1は大腸菌プラスミドpUF106とpUL1の1.15kbの部分からなることがわかった。この1.15kbの部分にロイシン合成遺伝子が存在している。この遺伝子が実際に酢酸菌ATCCー10245の遺伝子であることをビオチンを用いたサザンハイブリダイゼ-ションによって確認した。
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