家蚕プロテア-ゼインヒビタ-の生理機能と発現調節の生化学的研究

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01560064
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 佐々木 卓治 名古屋大学, 農学部, 助手 (20023492)
• キーワード: プロテア-ゼインヒビタ- / カイコアンチトリプシン / カイコアンチキモトリプシン / カイコキモトリプシンインヒビタ- / cDNAクロ-ニング / ノ-ザンブロット法 / ELISA法 / カイコの変態

研究概要

家蚕5令5日目幼虫脂肪体のポリ(A)RNAを用いて作製したcDNAライブラリ-から分子量42、000の2種のインヒビタ-、カイコアンチトリプシン(sw-AT)、およびアンチキモトリプシン(sw-Achy)の完全鎖長cDNAクロ-ンを得た。更にsw-Achyについては脂肪体DNAのMboI断片ライブラリ-よりゲノムDNAクロ-ンを得、sw-Achyが9個のエキソンによってコ-ドされることも明らかにした。Northern-Blot法によりsw-ATおよびsw-Achy-mRNAの脂肪体中の存在量の変動を4令期から蛹期にかけて観察した。その結果、sw-AT-mRNAは4令2日目と5令1日目に最大存在量を示し、4眠や前蛹期以降には消失した。sw-Achy-mRNAは4令2日目と5令3日目に最大存在量を示し、sw-ATと同様に4眠や前蛹期以降には消失した。一方、体液中のsw-ATおよびsw-Achyタンパク質の存在量をELISA法で測定すると、sw-ATは4令期には極微量しか存在せず、4眠で更に減少し、5令期の3日目から吐糸期にかけて15倍の増加を示した。sw-Achyは4令期ではsw-ATより高濃度に存在し、4眠ではsw-ATと同様に減少し、5令期1日目から蛹期にかけて7倍の増加を示した。また分子量7、000のキモトリプシンインヒビタ-(SCI)は4令2日目から5令5日目までは極微量しか存在せず、5日目から増加し始め9日目に8倍に増加し、吐糸期から蛹期にかけて再びもとの濃度にまで減少した。これらの変動パタ-ンの差について今後詳しく検討する予定である。SCIのcDNAクロ-ニングでは現在までに成熟SCI-IのN末端を欠く190塩基対のcDNA断片を得ており、これをプロ-ブとしてさらにライブラリ-よりスクリ-ニングを行い、完全鎖長cDNAクロ-ンを得るべく現在努力している。

研究成果

• [文献書誌] Takuji Sasaki: "Limited proteolysis of silkworm antitrypsin by several proteinases" Agric.Biol.Chem.54. 131-137 (1990)
• [文献書誌] Takuji Sasaki: "Single site proteolysis in silkworm antitrypsin causes structural changes in behavior against denaturing reagents" Agric.Biol.Chem.54. 139-145 (1990)
• [文献書誌] Hiroshi Takagi: "Amino acid sequence of silkworm(Bombyx mori)hemolymph antitrypsin deduced from its cDNA nucleotide sequence:Cofirmation of homology with serpins" Biochemistry.
• [文献書誌] Hajime Mori: "Nucleotide sequence of the polyhedrin gene of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus A strain with nuclear localization of polyhedra" J.Gen.Virol.70. 1885-1888 (1989)
• [文献書誌] Tsuchiyoshi Fujino: "Purification and properties of an endo-1,4-β-glucanase from Clostridium josui" J.Bacteriol. 171. 4076-4079 (1989)
• [文献書誌] Kenji Watanabe: "Properties of the purified extracellular cholesterol oxidase from Rhodococcus equi no.23" J.Agric.Food Chem.37. 1178-1182 (1989)