硫酸化チロシン蛋白質の形成とその機能解明(蛋白質チロシン硫酸化および脱硫酸化酵素の単離精製)

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01560102
• 研究機関: 宮崎大学
• 研究代表者: 水光 正仁 宮崎大学, 農学部, 助教授 (00128357)
• キーワード: 硫酸化チロシン / 翻訳後修飾 / ゴルジ体 / 牛肝臓 / ミクロゾ-ム / コレシストキニン / 硫酸転移酵素

研究概要

生体内において硫酸化は、多くの外因性や内因性の化合物の代謝や、タンパク質のチロシン残基や糖鎖の翻訳後修飾として重要な役割を演じている。これらの硫酸化は異なる硫酸転移酵素により活性硫酸(PAPS)から基質のOH基へ硫酸基を転移することにより行われる。種々の硫酸転移酵素は細胞質と膜の両画分に局在し、タンパク質チロシン硫酸化に関与する酵素(TPST)は、ゴルジ体の膜に結合する膜内在性糖タンパク質である。今回牛肝臓ミクロゾ-ム画分およびゴルジ体に存在する硫酸転移酵素の諸性質の検討と遺伝子工学の産物すなわちリコンビナントタンパク質の効率良いチロシン硫酸化を目的として研究を行った。
その結果、ゴルジ体を含むミクロゾ-ム画分にはシンプルフェノ-ル誘導体やチラミンやド-パミンを硫酸化し、熱安定性の低いモノアミンフォ-ムの新しい硫酸転移酵素が存在することを明らかにした。一方、牛肝臓のゴルジ体から調製したTPSTはZーGluーTyrやBocーCCKー8など数種のオリゴペプチドを硫酸化し、TyrのN端側がAspの時Gluに比べ効率よく硫酸化し、Lysの場合硫酸化しないことを明らかにした。このことよりTPSTの基質の認識はアミノ酸配列に依存していることが示唆された。また牛血清中の硫酸化チロシン結合性タンパク質(TSBP)を反応混液に加えることにより、Km値が1/10に減少した。
ヒル由来の血液凝固阻害剤ヒルジンは63番目のTyrのみ硫酸化を受けており、遺伝子工学的に酵母が生産したヒルジンは硫酸化されていないため、in vitroでの硫酸化が必要とされる。TPSTによる硫酸化を試みた結果、63番目のTyrのみの硫酸化に成功した。これらのことより、リコンビナントタンパク質の翻訳後修飾として、牛肝臓由来のTSPTを用いて特異的チロシン硫酸化が可能となった。

研究成果

• [文献書誌] MingーCheh Liu: "TyramineーOーsulfate,in Addition to TyrosineーOーsulfate,is Produced and Secreted by HepG2 Human Hepatoma Cells,but not by 3Y1 Rat Embryo Fibroblasts." Biochemistry International. 21. 815-821 (1990)
• [文献書誌] Jian Rong Han: "PostーTranslational Modifications and Binding Properties of the Apically Secreted 80ーkDa Glycoprotein from MadinーDarby Canine Kidney Cells:Similarities to the CーTerminal Portion of the Basolaterally Secreted Fibronectin." Archives of Biochemistry and Biophysics. 286. (1991)
• [文献書誌] Ruiliang Lu: "Purification and Characterization of a MembraneーBound TyrosineーOーSulfateーBinding Protein from Bovine Liver." Archives of Biochemistry and Biophysics. 286. (1991)
• [文献書誌] Masahito Suiko: "Quantitative Determination of TyrosineーOーsulfate in Urine:Application of IonーPair ReverseーPhase High Performance Liquid Chromatography in the Analysis of TyrosineーOーsulfate." Clinica.Chimica.Acta.(1991)
• [文献書誌] Masahito Suiko: "The Role of Tyrosine Sulfation in Protein: Activities of Several Sulfatases on Tyrosine Sulfated Proteins and Related Compounds." Biochemical Journal. (1991)
• [文献書誌] Masahito Suiko: "PostーTranslational Modification by Tyrosine Sulfation and Its FunctionsーDoes It Exist in Higher Plants?" Proceedings of the International Colloquium on Overcoming Breeding Barriers,Miyazaki,March 11ー15.59-65 (1991)