蛋白質耐熱化の一般則の構築に向けて:プロリン説の検証

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01560104
• 研究機関: 京都府立大学
• 研究代表者: 鈴木 譲 京都府立大学, 農学部, 教授 (50046471)
• 研究分担者: 渡部 邦彦 京都府立大学, 農学部, 助手 (90184001)
• キーワード: プロリン説 / 蛋白質耐熱化の一般則 / 蛋白質工学 / 耐熱性酵素 / プロリン残基 / オリゴ-1、6-グルコシダ-ゼ / 部位特異的変異

研究概要

中温菌Bacillus cereus ATCC7064(I)と通性好熱菌Bacillus coagulans ATCC7050(II)のオリゴ-1,6-グルコシダ-ゼのクロ-ン化酵素は、元菌株酵素と完全に一致することが判った。これらの構造遺伝子のDNA塩基配列も決定し、(I)は1,674bp、558のアミノ酸塩基から成る分子量66,010のポリペプチド鎖から成り、(II)は、1,665bp、555のアミノ酸残基から成る分子量64,953のポリペプチド鎖から成ることが判った。既に決定した絶対好熱菌Bacillus thermoglucosidasius KP1006(III)の本酵素遺伝子の結果と併せて、(I)〜(III)の本酵素は、分子量もほぼ等しくアミノ酸配列も57〜72%の相同性を有する。また注目するプロリン残基は、(I)19ケ→(II)24ケ→(III)32ケと、耐熱性獲得と共に上昇することがわかり、蛋白側から得た結果を強く裏付けするものになった。安定な本酵素にのみ出現するプロリン残基の座位は、Chou-Fasman法等の二次構造予測では、多くが折れ曲がり構造に存在しているが、置換される特異なアミノ酸残基の傾向はみられなかった。さらに(I)と(III)の遺伝子を融合させ、2種のキメラ酵素蛋白質を作り、耐熱性を調べると、(I)と(III)の間の耐熱性を示し、この酵素蛋白質中に熱安定性を支配するプロリン残基以外の特殊な部位の存在を否定することが出来た。(III)と高度好熱菌Bacillus flavocaldarius KP1228(IV)の間の生育温度を持つBacillus caldotenax KP1213の本酵素を純化し、耐熱性とプロリン含量を調べ、これまでと同様の相関性を得ることが出来た。(I)の本酵素の結晶化の前段階として、大腸菌の中での大量発現を試みた。ラクト-スオペロン由来のプロモ-タ-下流に(I)の遺伝子を繋ぎ、プロモ-タ-と構造遺伝子の距離を調節し、大腸菌前蛋白質の10%を越える発現量にまで達した。この菌体から大量精製を行い、100mg程度の純化酵素の容易な調整条件を確立し、結晶化を試みている。

研究成果

• [文献書誌] Suzuki,Yuzuru: "A general principle of increasing protein thermostability." Proc.Japan Acad.65ser.B. 146-148 (1989)
• [文献書誌] Suzuki,Yuzuru and Oishi,Kazumi: "A relationship between efficiency of isomaltosaccharide hydrolysis and thermostability of six Bacillus oligo-1,6-glucosidases." Appl.Microbiol.Biotechnol.31. 32-37 (1989)
• [文献書誌] Watanabe,K.,Ohashi,A.,Iha,H.and Suzuki,Y.: "Cloning and expression in Escherichia coli of an extremely thermostable olego-1,6-glucosidse gene from Bacillus theromglucosidasius." J.Bacteriol.171. 1219-1222 (1989)
• [文献書誌] Watanabe,K.,Iha,H.,Kitamura,K.and Suzuki,Y.: "Primary structure of the oligo-1,6-glucosidase of Bacillus cereus ATCC7064 deduced from the nucleotide sequence of the cloned gene."
• [文献書誌] 渡部邦彦,鈴木譲(分担執筆): "応用化学講座「遺伝子工学」(4章遺伝子の発現)" 木村光,村田幸作(朝倉出版), (1990)