| 研究課題/領域番号 |
01560129
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| 研究機関 | 岡山理科大学 |
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研究代表者 |
浄原 法蔵 岡山理科大学, 工学部, 教授 (50068904)
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| 研究分担者 |
滝沢 昇 岡山理科大学, 工学部, 講師 (50179579)
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| キーワード | Pseudoncnas putida / フェナントレン初発酸素添加酵素遺伝子 / Alcaligenes faecalis / プラスミド / インジコ生成 / 広宿主域コスミドベクタ- / in vitro packaging / 大腸菌 |
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| 研究概要 |
細菌による多環性芳香族炭化水素の分解酵素系の制御を遺伝子レベルで解明するために、Pseudomonas putida OUS82株のフェナントレン(PH)初発酸素添加酵素遺伝子(phn A)のクロ-ニングを行なった。
(1)phn A クロ-ンの検索方法の検討:既に報告されている。nah A geneの場合と同様に、Alcaligenes faecalis AFK2のpHK2プラスミド上のphn A geneもP.putida OUS82株のphnAおよびnah A genesもインド-ルからインジゴ生成することを見出した。(2)P.putida OUS82株のPHおよびNH(ナフタレン)分解とその制御:PHとその分解中間体である1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸(1H2NA)はプロトカテキン酸を経たPH分解経路とサルチル酸(SA)からカテコ-ルを経たNH分解経路の両者を誘導した。一方、NHを経たPH分解経路とサルチル酸(SA)からカテコ-ルを経たNH分解経路の両者を誘導した。一方、NHはPH全経路を誘導せず、また中間体であるSAもNH全経路のみを誘導した。このように、今までに知られていない代謝制御を持っていることが明らかとなった。(3)P.putida OUS82株からのphn A geneのクロ-ニング:クロ-ニングベクタ-として広宿主域コスミドベクタ-pLAFR1(tet)のEcoRIサイトにpUC4KのKmgene断片を挿入したpSTK10を構築した。このtet gene内SalIサイトにOUS82株全DNAのSalI消化20kb断片挿入して、in vitro packaging法で大腸菌に挿入し、インジコ生成したクロ-ンを得た。この組換え体はP.putida PpY101(met)内ではインジコ生成しなかったが、PHを変化させた。この断片をpUC119とpMFY43を用いて大腸菌(JM109とHB101株)内でサブクロ-ニングして、9.5kb断面を得た。現在、8.0kbまで切詰めている。このクロ-ンはPH酸化能を示し、phn A geneを含んでいることは明らかである。
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