研究概要 |
昨年度の研究によりキャディスティン類を特異的に紫外線吸収あるいは蛍光性を有する誘導体とし、高速液体クロマトグラフィ-(HPLC)を用い、高感度に分析する手法を確立した。さらに本手法を用いることにより、Cd^<++>処理及び無処理の稲の根中のキャディスティン類を分析して無処理の場合に主要SHヘプチドであるグルタチオンがCd^<++>処理により極度に減少し、キャディスティン類が誘導合成されてくる事と、無処理の場合でさえも極めて少量ながらキャディスティン類が含まれている事を見いだしている。本年度はこれら分析の標準試料となるべき、かつ、抗体作成のための抗原となるべきキャディスティン類を酵素合成する手法の確立をめざした。この酵素反応には構造決定の際に見いだしているカルボキシペプチダ-ゼの新奇な特異性を用いた。すなわち、カルボキシペプチダ-ゼはキャディスティン類の正常なCysーGly結合を切断するのみならずGluのαカルボキシル基をC末端として認識してCysーGlu結合を切断するがγーGluーCys結合は切断できないという特異性を利用し、グルタチオンを基質としてカルボキシペプチダ-ゼY処理によりキャディスティン類の合成を目指した。酵素反応生成物をHPLC分析した結果、6種の生成物を得、生成物のHPLC上の挙動、昨年度開発した誘導体化後のHPLC上の挙動およびSIMS分析の結果から主要な2種の生成物はキャディスティン(γーEC)_2Gと(γーEC)_3Gであることを明らかにすることができた。 さらに、その他の生成物はγーEC,(γーEC)_2と(γーEC)_3、および(γーEC)_2から脱水した生成物である事が判った。以上の結果を総合してグルタチオンのカルボキシペプチダ-ゼによる代謝経路を明らかにすると同時に、アミノ酸の保護や特殊な有機合成の技術を必要とせず、一段階の反応のみで極めて容易にキャディスティン類を酵素合成する道を開く事ができた。現在、この手法を発展させて大量合成法を開発している。
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