水産無脊椎動物レクチンの機能素材化

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01560229
• 研究機関: 北里大学
• 研究代表者: 村本 光二 北里大学, 水産学部, 助教授 (90157800)
• キーワード: レクチン / 無脊椎動物レクチン / 化学修飾 / フジツボ / 機能素材 / 糖結合

研究概要

本研究では、水産甲殻類アカフジツボ体液に含まれるレクチンを糖結合活性を持つ機能素材として利用するために、化学修飾と酵素修飾技術を使いレクチンの活性部位を決定すること及び糖結合活性を保持する修飾レクチンを作成することを目的にしている。アカフジツボレクチンは、構造を異にする140Kダルトンと64Kダルトンのレクチンからなる。これらは、それぞれ22Kと16Kのサブユニットが分子間ジスルフィド結合してダイマ-をつくり、さらに非共有結合して構成されている。そこで最初に、有機溶媒、尿素、グアニジン塩酸塩、pH変化のレクチンの高次構造と活性に対する影響を調べた。その結果、64Kレクチンは変性剤やpH変化に対し安定であることが分かった。一方、140Kレクチンはサブユニットに解離して活性が低下した。
64Kレクチンサブユニットは、128位に1残基のメチオニンを持つ。そこでブロムシアン分解により、そのペプチド結合を選択的に切断し、ゲル濾過クロマトグラフィ-で2つのジスルフィド結合で囲まれた糖認識結合ドメインを単離した。さらに、これを塩酸処理したセフアロ-ス4Bカラムにかけてガラクト-ス結合性を保持したドメインを得た。
D-ガラクトサミンのアミノ基に1-アジド-5-ナフタレンスルホニルクロライド(ANS-C1)を導入して、糖の発蛍光性光反応性誘導体(GalN-ANS)を合成した。64KレクチンをGalN-ANSと暗所で結合反応させた後、光照射した。光アフィニティ-ラベルしたレクチンをカルボキサミドメチル化し、プロナ-ゼで酵素消化した。消化物をHPLCで分離、ラベルされたペプチド断片を蛍光で検出した。アミノ酸分析の結果、標識部位はアミノ酸配列の比較から糖結合部位と推定された64位-70位のセグメントを含むものであることが同定された。

研究成果

• [文献書誌] K.Muramoto: "The amino-acid sequence of multiple lectins of acorn barnacle Megabalanus rosa and its homology with animal lectins" Biochim.Biophys.Acta. (1990)
• [文献書誌] K.Muramoto: "The positions of disulfide bonds and the glycosylation site in a lectin of the acorn barnacle Megabalanus rosa" Biochim.Biophys.Acta. (1990)
• [文献書誌] K.Muramoto: "Photoaffinity labeling of an acorn barnacle lectin with a photocativatable fluorescent reagent derivative of D-galactosamine" Dev.Comp.Immunol.
• [文献書誌] H.Kamiya: "Purification and characterization of an antibacterial and antineoplastic protein secretion of a sea hare,Aplysia juliana" Toxicon. 27. 1269-1277 (1989)
• [文献書誌] J.Kisugi: "Purification of a novel cytolytic protein from albumen gland of the sea hare,Dolabella auricularia" Chem.Pharm.Bull.37. 2773-2776 (1989)
• [文献書誌] M.Yamazaki: "Isolation and characterization of a novel cytolytic factor in purple fluid of the sea hare,Aplysia kurodai" Cancer Res.49. 3834-3838 (1989)