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X染色体が不活性化される初期胚盤胞期まで、胚のX染色体連関酵素の活性は雌が雄の2倍であると考えられているが、牛胚に関する研究は皆無である。そこで初年度である本年は、牛卵巣より採取した未成熟卵子および体外受精により作出した牛胚を用いて、X染色体連関酵素の一つであるグルコ-ス6リン酸脱水素酵素(G6PDH)活性の非破壊的微量測定法の開発を試みた。すなわち蛍光顕微鏡に接続した顕微測光装置を用い、NADPHの蛍光度を測定した結果、検量線は0-1.0nmol/μlの間で直線性を示し、本装置によるG6PDHの微量測定の可能性が示された。つぎに未成熟卵子を基質反応液と共に1時間インキュベ-トし、顕微測光装置により非破壊的にG6PDH活性の測定を試みたが、反応液中に卵子からのNADPHの放出は認められなかった。そこで卵子および胚を、プロナ-ゼ処理により透明帯を除去し、EDTAおよびメルカプトエタノ-ルを含む抽出液と共に、10μl容量のガラス管中で液体窒素により凍結・融解を繰り返し、さらに遠心分離操作を加えることにより、卵子および胚の抽出液を作製した。この抽出液(1μl)を補酵素を含む基質溶液と共に反応させた後、顕微測光装置により蛍光度を測定したところ、卵子および胚のG6PDH活性の微量測定に成功した。G6PDH活性の発生に伴う変動は、すでに組織化学的に検討した結果と一致し、測定の正当性が確認された。
次年度は4〜8細胞期胚の一部割球をマイクロマニピュレ-ションにより摘出し、今回開発した方法を用いてこれら割球のG6PDH活性を測定し、残りの割球を用いて染色体検査により性判別することにより、本酵素活性の性差を検討したい。
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