| 研究課題/領域番号 |
01570070
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
有田 順 横浜市立大学, 医学部生理学第2講座 助教授 (80128587)
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| 研究分担者 |
船橋 利也 横浜市立大学, 医学部生理学第2講座, 助手 (70229102)
橋本 隆平 横浜市立大学, 医学部生理学第2講座, 講師 (70189512)
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| キーワード | 神経細胞 / 分泌 / 神経ペプチド / 視床下部 / 可視化 / 定量法 |
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| 研究概要 |
1(1)ラット培養視床下部神経細胞を用いて、単一細胞レベルのソマトスタチン分泌の可視化と定量化を試みた。
(2)前年度の研究によって転写膜の高いバックグランドが使用した抗体によるものであることが示されたので、サイログロブリンーソマトスタチン結合物に対する抗体を作製した。これを用いることにより、バックグランドの濃淡レベルが著明に低下した。
2単一細胞からのソマトスタチン基礎分泌は検出感度以下であることが前年度の研究でわかったので、50mMKC1及び50uMベラトリヂンの脱分極刺激によって誘発されるソマトスタチン分泌を調べたが、殆どの細胞で検出できなかった。
3免疫染色の検出感度を上げることが必要と考えられたので、市販の免疫染色キットを各種比較し、アマシャム社製キットが他社のものより5〜8倍高感度であることがわかった。しかし、この高感度キットを用いることにより、これまで観察されなかった非特異的細胞ブロット(偽陽性ブロット)像が現れた。このブロット像は10%正常ロバ血清の前処理及び抗体反応液中へのTween20の添加によって消失した。
4以上の方法の改善にもかかわらず単一細胞からのソマトスタチン分泌は可視化されなかった。視床下部に多く含まれている神経ペプチドのsubstance Pについてもsubstance P抗体を用いて同様の実験を行ったが、やはり分泌像は認められなかった。しかし、substance Pを分泌する内分泌細胞の下垂体培養細胞では同様の方法によってsubstance P免疫陽性ブロット像が観察されたことから、培養神経細胞からのペプチド分泌の単一細胞レベルでの可視化と定量化が困難なのはペプチドの分泌量が非常に少ないためであることが考えられた。
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