細胞内セカンドメッセンジャ-間相互作用の遺伝子工学的研究

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01570103
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 久野 高義 神戸大学, 医学部, 講師 (50144564)
• キーワード: サイクリックAMP / 蛋白質燐酸化酵素 / 遺伝子工学

研究概要

ホルモンや神経伝達物質による細胞内情報伝達の仕組みの中で、種々のセカンドメッセンジャ-の作用点である蛋白質燐酸化酵素の重要性は確立されているが、セカンドメッセンジャ-間の相互作用については不明は点が多い。本研究はセカンドメッセンジャ-の一つであるcAMPの細胞内における主要な標的分子であるcAMP依存性蛋白質燐酸化酵素の制御サブユニットを遺伝子工学的に改変し、cAMP系を細胞内で阻害するブロッカ-として利用し、cAMP系を中心とした、セカンドメッセンジャ-間相互作用の解析を目的とした。(1)cAMP依存性蛋白質燐酸化酵素制御サブユニット変異体の作製:ラット脳cDNAライブラリ-からI型制御サブユニットの全長をコ-ドするcDNAを得た。1つのサブユニット内に2つ存在するcAMP結合部位A及びBに点突然変異を導入し、1サブユニット当り1つのcAMPしか結合しない変異体を作製した。(2)変異体の発現と特性解析:野性及び変異体制御サブユニットを大腸菌において発現させ、cAMPアフィニティ-カラムを用いて精製した後、ウシ心臓から精製した触媒サブユニットとのホロエンザイム形成とそのcAMPによる活性化について調べた。その結果変異体制御サブユニットでは、高親和性のcAMP結合は認められるものの、変異体制御サブユニットが形成するホロエンザイムでは野性のもので最大の活性化が認められる濃度の100倍量のcAMPを加えても殆ど活性化されなかった。
以上の結果は本研究において作製された変異体がcAMPを介したセカンドメッセンジャ-系を阻害することを示している。このことはアフリカツメガエル卵を用いたモデル系でも確認され、有用なバイオブロ-ブとして種々の細胞系での利用が期待される。

研究成果

• [文献書誌] T.Takeda: "A rapid filtration assay for cAMP." J.Biochem.105. 327-329 (1989)
• [文献書誌] Y.Ono: "Phorbol ester binding to protein C requires a cysteinerich zinefinger like sequence." Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86. 4868-4871 (1989)
• [文献書誌] K.Saijoh: "Molecular cloning of cDNA for rat brain metallothioneinーII and requlation of its gone expression." Pharmacol.Toxicol.64. 464-468 (1989)
• [文献書誌] T.Kuno: "Activation of type I cyclic AMPーdependent protein kinases is impaired by a point mutation in cyclic AMP binding sites." Eur.J.Pharmacol.172. 263-271 (1989)
• [文献書誌] A.Ito: "The complete primary structure of calcineurin A,a calmodulin binding protein homologous with protein phosphatases 1 and 2A." Biochem.Biophys.Res.Commun.163. 1492-1497 (1989)
• [文献書誌] T.Kuno: "Evidence for a second isoform of the catalytic subunit of calmodulinーdependent protein phosphatase(calcineurin A)." Biochem.Biophys.Res.Commun.165(3). 1352-1358 (1989)