| 研究概要 |
本研究では,動物細胞のコリンキナ-ゼ(CK2)及びホスファチジルエタノ-ルアミンーN+メチル化酵素(PEM)をコ-ドする遺伝子の単離を試みた。最初に,既に我々が単離しその構造を明らかにしてある酵母のCK2及びPEM2遺伝子の一部をラベルし,ラット肺CDNAファ-ジライブラリ-のプラ-クハイブリダイゼ-ションを行った。種々の条件を変化させるがら数回の実験を行なったが目的とする遺伝子を得ることができなかった。次に、酵母内発現ベクタ-にラット肺CDNAライブラリ-を組み込むことを行ない、この遺伝子発現により酵母のchi,pem2変異を抑制する性質を利用し,クロ-ニングを試みた。しかしながら数回の試みを行なったがポジティブなクロ-ンを得ることができなかった。この原因を調べたところ,発現ベクタ-内に組込まれたCDNAの長さが不十分であるらしいことが判明し,CDNAの合成には熟練した技術が必要であるとの結論を得た。ところで3番目に岡崎と岡山により開発された分裂酵母変異株相補法(第12回日本分子生物学会講演要旨集238頁)を試みることにした。この目的のため大阪大学の岡山教授より人肺細胞由来のCDNAライブラリ-の供与を受けた。また新たに分裂酵母変異株を得るために,野生株をエテルメタンスルホン酸処理後,増殖にコリンを要求するものとしてSPCI,SPC2株を単離した。中間代謝産物及び酵素活性を測定することにより後者が目的とするpem2変異株であることを同定した。従って現在この方法の準備が完全に整った段階である。一方動物のモデル系としてサッカロミセス酵母を用い,ホスファジルメタノールアミンメチル化経路の調節機構についても解析した。PEM1,PEM2遺伝子の5^1上流側を解析したところ,共通配列として5^1ーCATRTGAAー3^1なる配列が存在することを見出し,この配列がコリンとイノシト-ルによるリン脂質メチル化酵素の調節に関子することを発見した。
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