肺ロイコトリエンD_4受容体の生化学的研究

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01570125
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 渡辺 毅 東京大学, 医学部・(病)第一内科, 助手 (80158641)
• 研究分担者: 寺本 民生 東京大学, 医学部・(病)第一内科, 助手 (20133077) ; 清水 孝雄 東京大学, 医学部・栄養学, 助教授 (80127092)
• キーワード: ロイコトリエン / 肺 / 受容体 / 遺伝子クロ-ニング / 卵母細胞 / 蛋白可溶化 / 百日咳毒素 / GTP結合蛋白

研究概要

本研究の目的は喘息等の病態の重要なメディエ-タ-であるロイコトリエン(LT)D_4の肺の受容体の性質及び情報伝達機構を分子レベルで解明することであり、以下の二つの方法を用いた。
1)肺LTD_4受容体蛋白の生化学的追求
モルモット肺の膜分画よりLTD_4受容体、同様に脾臓のLTB_4受容体をさまざまの界面活性化剤を用いて活性の可溶化を試みた結果、CHAPSを用いて効率よく活性型のまま可溶化に成功した。この可溶化蛋白はカラムクロマトにより部分精製され、受容体蛋白は分子量約7万の糖蛋白であることが判明した。また、百日咳毒素を用いてこの受容体が百日咳毒素感受性のGTP結合蛋白と連関していることが証明された(文献1、2)。しかし、可溶化された受容体活性は不安定で受容体蛋白の単一蛋白としての精製には至らなかった。
2)発現系を用いた受容体蛋白cDNAのクロ-ニング
モルモット肺より抽出したmRNAより作成したcDNAをλベクタ-に組み込みcDNAライブラリ-を作成した。またアフリカツメガエル卵母細胞に肺のmRNAを注入しLTD_4に反応するCa^<2+>依存性のCl電流をvoltage clamp法にて感知する電気生理的方法によるスクリ-ニングにより受容体蛋白をコ-ドしたcDNAのクロ-ニングを試みた。肺LTD_4受容体のクロ-ニングは当該年度中には成功せず、現在進行中である。しかし、同じcDNAライブラリ-を用いて、血小板活性化因子(PAF)の遺伝子クロ-ニングに成功し、その核酸、アミノ酸配列、hydropathicity profileなどから受容体蛋白の構造を明らかにした。また、COS細胞での受容体の発現にも成功している。(文献3)

研究成果

• [文献書誌] I.Miki,T.Watanabe et al.: "Solubilization and characterization of leukotriene B_4 receptorーGTPーbinding protein complex from porcine spleen" Biochem.Biophys.Res.Commun.166. 342-348 (1990)
• [文献書誌] T.Watanabe et al.: "Characterization of the guinea pig lung membrane leukotriene D_4 receptor solubilized in an active form;" J.Biol.Chem.265. 21237-21241 (1990)
• [文献書誌] Z.Honda,M.Nakamura,I.Miki,M.Minami,T.Watanabe et al.: "Cloning by functional expression of guinea pig lung platelet activating factor (PAF) receptor" Nature. 349. 342-346 (1991)
• [文献書誌] 渡辺 毅,清水 孝雄: "ロイコトリエン受容体とGTP結合蛋白実験医学(増刊)8,14、128ー132" 羊土社, 5 (1990)
• [文献書誌] 渡辺 毅: "ロイコトリエン受容体とGTP結合蛋白実験医学9,1,31ー37" 羊土社, 7 (1991)