1989 年度実績報告書

遺伝子操作法を用いたアスパラギン酸トランスアミナ-ゼの触媒反応機構の解析

研究課題

研究課題/領域番号	01570144
研究機関	大阪医科大学
研究代表者	倉光成紀大阪医科大学, 医学部, 助教授 (60153368)
キーワード	アスパラギン酸トランスアミナ-ゼ / アスパラギン酸アミノ基転移酵素 / 酵素工学 / 蛋白工学 / 触媒反応機構 / 基質認識機構 / 部位特異的置換法 / ストップトフロ-法
研究概要	大腸菌アスパラギン酸トランスアミナ-ゼのX線結晶解析に成功したので、その結果をもとにして、活性部位のアミノ酸残基(Tyr70、Trp140、His143、Asp222、Tyr225、Lys258、Arg292、Arg386など)を部位特異的変異法で置換し、約50種類の変異型酵素遺伝子を作製した。次に、この変異型酵素の遺伝子を高コピ-ブラスミドに組り込み、大腸菌aspC欠損株を形質転換する事によって、酵素を数百倍量産化する系を確立した。活性中心に存在する補酵素(ピリドキサ-ルリン酸)の吸収帯が紫外〜可視波長領域に存在するので、その分光学的特性を利用して、野生型酵素と基質との反応過程をストップトフロ-法で解析した。その結果、酵素反応過程は、速い結合過程と遅い過程(基室のプロトンが引き抜かれる過程)の2つの反応過程から成る事が明らかになった。そこで次に、変異型酵素と基室との反応過程を解析して、各反応素過程における活性部位のアミノ酸残基の役割を解析した所、速い基室結合過程にはArg292、Arg386、Lys258、Trp140等がおもに関与し、遅い律速過程にはLys258、Asp222、Tyr225等が関与することを明らかにした。また、変異型酵素のうち、数種類の酵素については反応中間体を捉えることができた。変異型酵素の活性について解析する際には、これら変異酵素の立体構造を精密に解析し、野性型酵素の立体構造と比較しておく必要があるので、野生型およびすべての変異型酵素についてX線結晶解析を行いつつある(大阪市立大学・理学部・広律建博士との共同研究)。野生型酵素については0.20nm分野能のまでの解析が終わり、約数種類の変異型酵素についてもすでに解析を終えた。現在、残りの変異型酵素についてもX線結晶解析を進めつつある。

研究成果
(6件)

すべてその他

すべて文献書誌 (6件)

[文献書誌] Inoue,Y.: "substitution of A Lysyl Residue for Arg386 E.coli Aspartate Aminotransferase" J.Biol.Chem.264. 9673-9181 (1989)
[文献書誌] Hayashi,H.: "〔Arg292→Val〕or〔Ang292→leu〕Mutation Enhances the Reactivity of E.coli Aspartate Aminotransfevase tawards Aromatic Amino Acids" Bischem.Biophys.Res.Commun.159. 337-342 (1989)
[文献書誌] Nagashima,F.: "CDNA Cloning and Expuession of Pig Cytosolic Aspartate Aminotransferase in E.coli:Amino-Terminal Heterogeneity of Expressed Products and Lack of Its Correlation with Enzyme Function" Biochemistry. 28. 1153-1160 (1989)
[文献書誌] Kamitori,S.: "Preliminary X-ray Characterization of Branched-Clain Amino Acid Aminotransferase of Eschericlbh coli" J.Bischem.105. 671-672 (1989)
[文献書誌] Hayashi,H.: "Effects of Replacement of Tryptophan-140 by Phenylalanine or Glycine on the function of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase" Biochem.Biophys.Res.Commun.(1990)
[文献書誌] Kuramitsu,S.: "Pre-Steady State Kinetics of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase-Catalyzed Reactions and Thermodynamic Aspects of Its subithrate Specificity" biochemisry. 29. (1990)

1989 年度 実績報告書

遺伝子操作法を用いたアスパラギン酸トランスアミナ-ゼの触媒反応機構の解析

研究代表者

倉光 成紀 大阪医科大学, 医学部, 助教授 (60153368)

研究成果

[文献書誌] Inoue,Y.: "substitution of A Lysyl Residue for Arg386 E.coli Aspartate Aminotransferase" J.Biol.Chem.264. 9673-9181 (1989)

[文献書誌] Hayashi,H.: "〔Arg292→Val〕or〔Ang292→leu〕Mutation Enhances the Reactivity of E.coli Aspartate Aminotransfevase tawards Aromatic Amino Acids" Bischem.Biophys.Res.Commun.159. 337-342 (1989)

[文献書誌] Nagashima,F.: "CDNA Cloning and Expuession of Pig Cytosolic Aspartate Aminotransferase in E.coli:Amino-Terminal Heterogeneity of Expressed Products and Lack of Its Correlation with Enzyme Function" Biochemistry. 28. 1153-1160 (1989)

[文献書誌] Kamitori,S.: "Preliminary X-ray Characterization of Branched-Clain Amino Acid Aminotransferase of Eschericlbh coli" J.Bischem.105. 671-672 (1989)

[文献書誌] Hayashi,H.: "Effects of Replacement of Tryptophan-140 by Phenylalanine or Glycine on the function of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase" Biochem.Biophys.Res.Commun.(1990)

[文献書誌] Kuramitsu,S.: "Pre-Steady State Kinetics of Escherichia coli Aspartate Aminotransferase-Catalyzed Reactions and Thermodynamic Aspects of Its subithrate Specificity" biochemisry. 29. (1990)

1989 年度実績報告書

倉光成紀大阪医科大学, 医学部, 助教授 (60153368)