| 研究課題/領域番号 |
01570231
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
細菌学
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
中村 信一 金沢大学, 医学部, 教授 (90019620)
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| 研究分担者 |
山川 清孝 金沢大学, 医学部, 助手 (20110629)
神谷 茂 金沢大学, 医学部, 講師 (10177587)
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| 研究期間 (年度) |
1989 – 1990
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| キーワード | C.difficile / トキシンA / 電気泳動 / サブユニット / モノクロ-ナル抗体 / 酵素抗体法 / 中和活性 |
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| 研究概要 |
高度精製Clostridium difficileトキシンAをサイログロブリンアフィニティクロマトグラフィ-に2種の陰イオン交換カラムクロマトグラフィ-(QSepharose FF,Mono Q)を併用することにより得ることができた。最終標品は未変性PAGE上分子量520〜540KDaの単一バンドとして泳動された。本精製毒素は非還元下でのSDSーPAGEの結果、分子量240KDaの主バンド、分子量38〜345KDaの10種のマイナ-バンド及び分子量46〜440KDaの27種のフェイントバンドとして泳動され、またBーメルカプトエタノ-ルを添加し還元下でSDSーPAGEを行うと分子量240KDaのバンド、38〜345KDaの4種のマイナ-バンド及び分子量46〜440KDaの31種フェイントバンドとして泳動された。2次元電気泳動の結果、非還元下で検出された分子量255〜345KDaの7種のマイナ-バンドは還元後240KDaの主バンドに変化した。これらの結果はトキシンAは240KDaよりも小さな分子量をもつサブユニットから構成されている可能性を示唆する。精製トキシンAに対するモノクロ-ナル抗体(MAb)の作製を試みた結果、9種類(2E15、3B4、37B5、45A3、46Ab、49c4、61B5、112Gb)のMAbが得られた。MAbのアイソタイプは、37B5がIgG2b、Kであり、他は全てIgM、Kであった。37B5のELSA価は10^5で最も高く、次いで2E15、3B4、23C5、46A6では10^4で、他は10^3であった。トキシンAの未変性PAGE後のイムノブロッテイングでは112G6以外の8種のMAbは全て540KDaのトキシンAがバンドと反応したが、特に37B5が強く反応した。SDSーPAGE後のイムノブロッティングでは、2E15、3B4、37B5、49C4のみが240KDaのバンドと反応した。トキシンAのル-プ活性、マウス致死活性、細胞毒性、赤血球凝集活性に対する中和能を検討した結果37B5はル-プ活性を中和したが、他のMAbはいかなる生物活性も中和しなかっった。以上の結果は赤血球凝集活性がトキシンのAのル-プ活性の発現に必須ではないことを示している。
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