| 研究概要 |
(1)純系マウス(C3H/He)マクロファ-ジ(Mφ)を^<32>P正リン酸でラベル後、変の細菌内毒素(LPS)で刺激し、Mφ内に出現するリン酸化蛋白(phospho protein;PP)を定量した。刺激後、15-30分で、数種のPPが出現し、これはモノカインの産生などのMφの最終応答に先行した。(2)これらのPPはMφ内で特長的に局在していた。即ち、PP65とPP28は細胞質分画中に、PP58,PP43,PP33とPP19は細胞膜分画中に、PP105とPP75は両者に、それぞれ局在していた(PPの後の数字は分子量を示す)。また、これらのPPは、LPS不応答性C3H/HeJマウスMφでは認められず、LPSによるMφ活性化において必須の蛋白群と考えられる。(3)これらのPP中、最も強くリン酸化される細胞質蛋白(PP65)を、ゲル濾過カラム、イオン交換HPLCカラム、ハイドロキシアパタイトHPLCカラムにて、単一標品にまで精製した。アミノ酸組成の分析では、Asx,Glx,Leu,Lysが多かった。(4)PP65のN末端は何らかの修飾をうけており、検出できなかった。そこでPP65(100μg)を酵素処理(リシルエンドペプチダ-ゼ)して得た約10個のペプチド中の2個のペプチドをアミノ酸配列を気相シ-クエンサ-にて決定した。得られた配列を既知の蛋白質の配列と比較したところ、一致するものはなく、新しい蛋白質であることがわかった。(5)PP65(100μg)をウサギに免疫して抗血清を得た。この抗体を用いて、蛍光抗体法にてMφ内の局在を調べると、細胞質内にほぼ一様に分布していた。また、本抗体を用いて、ウエスタンブロット法でPP65(非リン酸化蛋白P65を含む)を定量すると、HeJ-Mφにも正常Mφとほぼ同量の蛋白が存在していることがわかった。LPS刺激で生ずるPPが精製、構造決定されたのは初めてのことである。平成元年度の研究計画の全て、及び平成2年度の研究計画の一部がすでに達成された。
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