細菌内毒素刺激でリン酸化される細胞内蛋白質の精製、構造決定とそのキナ-ゼ特異性

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01570243
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 四宮 博人 自治医科大学, 医学部, 講師 (80162618)
• 研究分担者: 中野 昌康 自治医科大学, 医学部, 教授 (70048958)
• キーワード: 細菌内毒素(LPS) / マクロファ-ジ / リン酸化蛋白(PP) / C3H / HeJマウス / PP65 / プラスチン / 遺伝子クロ-ニング / プロテインキナ-ゼ

研究概要

細菌内毒素(LPS)は強力な免疫賦活物質であるが、作用機序の詳細は不明である。LPSでマウスマクロファ-ジ(細菌感染防禦において重要な細胞;Mφ)が刺激されると、数種のMφ内蛋白質が特異的にリン酸化されることを既に報告した。このうち最も強くリン酸化される65kDa細胞質蛋白(PP65)を単離精製し、抗PP65抗体を調製した(前年度)。これらを基に、本年度は以下の結果を得た。(1)PP65の部分アミノ酸配列を決定し、既知の蛋白質との異同をコンピュ-タ-検索により調べたところ、一致するものはなく、新蛋白質と考えられたが、その後の検討で、hinらがヒト癌化線維芽細胞から単離したプラスチンという新種の蛋白質と高い相同性のあることが分かった。(2)抗PP65抗体を用いて、Mφ内に生成したPP65を免疫沈降し、LPS刺激により生ずるPP65の程度を、他の非特異的なPPの防害なしに定量する系を確立した。この免疫沈降法により、LPS刺激後、30分以内にPP65の生成量はプラト-に達し、3時間後には減弱することが明らかになった。LPS不応答性C3H/HeJマウス由来のMφでは、PP65の生成は微弱であった。また、LPSの活性中心であるlipid AでもPP65は生じた。(3)抗PP65抗体を用いたWestern Blot法にて、Mφ以外の細胞中のPP65及びその非リン酸化蛋白(P65)の存在を調べた。Mφの他、脾B細胞、脾T細胞、多核白血球中に認められたが、胸腺T細胞や骨髄細胞中には認められなかった。興味あることに、HeJ細胞中にもP65は認められたが、LPS刺激でPP65は生成しないことから、HeJ細胞の機能欠損は、PP65のリン酸化以前に存在することが示唆された。(4)PP65の部分アミノ酸配列を基に、オリゴDNAを合成し、遺伝子クロ-ニングの技法を用いて、PP65をコ-ドする遺伝子のサブクロ-ニングを行なった。また、LPS刺激で誘導され、P65をリン酸化するプロティンキナ-ゼはCa^<2+>を必要とせず、PKCとも異なることが示唆された。

研究成果

• [文献書誌] YASUHIKO TERADA: "Defect of calmodulinーbinding protein in expression of interleukinーl gene by LPSーnonresponder C3H/HeJ mouse macrophages." Biochem.Biophys.Res.Commun.158. 723-729 (1989)
• [文献書誌] HIROTO SHINOMIYA: "Characterization and purification of the LPSーinduced phosphoproteins in murine peritoneal macrophages." Jpn.J.Sci.Biol.42. 185-190 (1989)
• [文献書誌] HIROTO SHINOMIYA: "Intracellular singnal transducellular tranasductional initiated by bacterial endotoxins." Antibiot.Chemotherap.5. 47-53 (1989)
• [文献書誌] MASAYASU NAKANO: "Possible refractory site on LPSーinduced interleukinーl prodaction in C3H/HeJ peritoneal macrophages" Adv.Exp.Med.Sci.256. 347-360 (1990)
• [文献書誌] HIROTO SHINOMIYA: "Highーpetformance liquid chromatographic separation of a phosphorylated form of 65 kDa macrophage cytosolic protein from its unphosphorylated form." J.Chromatograph.(1991)
• [文献書誌] HIROTO SHINOMIYA: "Purification and characterization of the 65,000ーdalton Protein phosphoryland in murine macrophages by stimulation with lipopolysaccharide" J.Immunol.(1991)
• [文献書誌] HIROTO SHINOMIYA: "Involvement of a plastinーlike novel phosphoprotein in intracellar process of macrophage activation by bacterial lipopolysaccharide"
• [文献書誌] HIROTO SHINOMIYA: "Preparation of specific antibody agaist pp65 of murine macrophages:examination on distribution of the 65 kDa protein in other cells or tissues."
• [文献書誌] HIROTO SHINOMIYA: "cDNA cloning for a novel phosphoprotein of murine macrophages"
• [文献書誌] MASAYASU NAKANO: "Endotoxin Research Series,Vol.l.,in press." Ed.by Nowotny,A.,et al.Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam,300-400 (1991)
• [文献書誌] HIROTO SHINOMIYA: "Endotoxin in gastrointestinal and liver disease,in press" Ed.by Mizuno,M.et al.Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam., 300-350 (1991)
• [文献書誌] MASAYASU NAKANO: "Bacterial Endotoxic Lipopolysaccharides" Ed.by Morrison,D.C.CRC Press Inc.,New York., 300-400 (1991)