| 研究課題/領域番号 |
01570340
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| 研究機関 | 琉球大学 |
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研究代表者 |
永盛 肇 琉球大学, 医学部, 教授 (50045605)
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| 研究分担者 |
長嶺 勝 琉球大学, 医学部, 助手 (20189161)
梶原 正弘 杏林大学, 医学部, 助手 (30152656)
内間 栄行 琉球大学, 医学部, 助手 (90093377)
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| キーワード | 個人識別 / 親子鑑定 / DNA多型 / サザンハイブリダイゼ-ション / DNAフィンガ-プリント / ビオチン化プロ-ブ |
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| 研究概要 |
DNAフィンガ-プリントを実施する場合のプロ-ブの標識方法としては、放射性同位元素を用いるのが一般的であるが、取り扱いや使用期限などの制約があり不便な点が多いので、我々はビオチン化標識プロ-ブの使用を検討してきた。Jeffreysらが開発したミニサテライトプロ-ブ"Myo"にSP6システムを用いてビオチン化UTPを取り込ませたRNAプロ-ブを合成した。このプロ-ブでサザンハイブリダイゼ-ションを行った後に、アルカリホスファタ-ゼ標識ストレプトアビジンを反応させ、発色試薬の基質を加えてバンドを検出した。しかしこの方法では明瞭なフィンガ-プリントを得ることはできなかった。スメア状の発色は認めるが、明らかにバンドと思われるものは一本か二本しかなく実際の検査に使えるものではなかった。その理由として、感度が不十分だと考え、ABCキットを用いて感度を上げることを試みた。しかしバックグラウンドの増加が見られただけで改善にはならなかった。洗浄条件その他の検討を重ねたが明瞭なバンドを検出するに至らず、そのうちにビオチン化UTPの販売が中止になりビオチン化RNAプロ-ブの使用を断念した。そこで我々はビオチン化オリゴヌクレオチドプロ-ブを用いる方法を試みた。"Myo"の33塩基の繰り返し単位を固相アミダイト法によりDNAシンセサイザ-で合成し、5'末端にヘキシルアミンを介してビオチンを導入したものをプロ-ブした。緩い条件で洗浄し検出キットを用いて発色した。これにより明瞭なフィンガ-プリントが得られ、放射性同位元素で標識した場合と同等のバンドが検出された。数家族のDNAフィンガ-プリントを行い,親子鑑定が可能であることを確認した。現在ではビオチン以外にも非放射性プロ-ブを用いて高感度の分析が可能であり、DNAフィンガ-プリント法は、一般的な方法として広く応用されるものと思われる。
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