細胞融合法によるド-パミン性神経細胞株の確立-パ-キンソン病研究への応用-

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01570454
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 新島 健司 自治医科大学, 医学部, 講師 (80150613)
• 研究分担者: 小川 松夫 自治医科大学, 医学部, 助手 (50194452)
• キーワード: hybridization / cell line / 5-hydroxytriptamine / serotonin

研究概要

1.Hybridizationを行うための基礎的検討
マウスの中枢神経細胞とNeuroblastoma(N18TG2)とのhybrid cell lineを得るために以下の検討を行った。その結果、(1)primary cellとNeuroblastomaの混合比率は、1:1もしくは2:1で良好な結果が得られた。(2)polyethylene glycol法を用いた場合、MW1000-4000を用い、濃度は40-50%(W/W)、反応時間は1.5-15分でhybrid cellが得られた。
2.Hybrid cell lineのcharacterization
得られたhybrid cellをcloning(limiting dilution)し、6個のcell lineが樹立した。これをchamber glass(Lab-Tek)で培養し、固定後、免疫組織染色を行った。使用した抗体は、抗Tyrosine Hydroxylase(TH)抗体、抗Neuron specific enolase(NSE)抗体、抗5-Hydroxytriptamine(5HT)抗体、抗γ-aminobutyric acid(GABA)抗体、抗Dopamine抗体、抗Glial fibrillary acidic protein(GFAP)抗体である。6個のcell lineのうちNTK6は、抗5HT、抗TH抗体陽性、NTK8は、抗GABA抗体陽性の細胞が含有していた。今回はNTK6に集中し、さらにlimiting dilutionによりcloningした。28個のcell lineが新たに樹立され、NTK6-39が、もっとも5HT-immunoreactivityが高い、cell lineであった。これをNeurochemにより5HT含有量を測定すると、NTK6-39は3.2ng/107cells、N18TG2は、0.04ng/107cellsと、Serotominを含有したcell lineであることが分った。現在のところド-パミン性神経細胞株は、樹立しておらず、今后このteckniqueを用いて、樹立に向けて努力したいと考えている。

研究成果

• [文献書誌] Niijima,K.,Araki,M.,Ogawa,M.,Nagatsu,I.,Sato,F.,Kimura,H.,and Yoshida,M.: "Enhanced survival of cultured dopamine neurons by soluble extracts from chemically deafferented striatum." Brain Research.
• [文献書誌] Niijima,K.,Araki,M.,Mizuno,Y.,Ogawa,M.,Nagatsu,I.,and Yoshida,M.: "N-methylisoquinolinium ion destroys mesencephalic dopamine neurons in culture." Neuroscience letter.
• [文献書誌] Niijima,K.,Araki,M.,Ogawa,M.,Nagatsu,I.,and Yoshida,M.: "Striatal extracts from patients with parkinson's disease promote neurite outgrowth from mesencephalic dopamine neurons." Neurology.
• [文献書誌] Fujimoto,K.,Yoshida,M.,Ikeguchi,K.,and Niijima,K.: "Imparement of active avoidance produced after destruction of pedunculopontine nucleus area in the rat." Neuroscience Research. 6. 321-328 (1989)
• [文献書誌] Kamegai,M.,Niijima,K.,Kunishita,T.,et al: "Interleukin 3 as a nerve trophic factor for central cholinergic neurons in vitro and in vivo." Neuron.(1990)
• [文献書誌] Ogawa,M.,Araki,M.,Nagatsu,I.,Nagatsu,T.,and Yoshida,M.: "Astroglial cell alterration caused by neurotoxins;immunohistochimical observations with antibodies to glial fibrillary acidic protein,laminin,and tyrosine hydroxylase" Experimental Neurology. 106. 187-196 (1989)