胎児性胆汁酸を指標とする先天性肝胆道疾患診断法の開発

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01571182
• 研究機関: 東日本学園大学
• 研究代表者: 池川 繁男 東日本学園大学, 薬学部, 助教授 (90111301)
• 研究分担者: 藤間 貞彦 東日本学園大学, 薬学部, 助教授 (30001043)
• キーワード: 胎児性胆汁酸 / イムノアッセイ / 高速液体クロマトグラフィ- / 化学発光 / 3α-hydroxysteroid dehydrogenase / 1β-hydroxycholic acid / 固定化酵素

研究概要

先天性胆汁酸代謝異常症のマススクリ-ニングによる早期診断治療を究極の目標にかかげ、今年度はイムノアッセイに必要不可欠な試薬として、胎児新生児に特有な胆汁酸の特異抗体を調製した。又、精密診断の基盤として、高速液体クロマトグラフィ-による高感度系統分析法を確立し、尿試料へ適用して胎児性胆汁酸の由来並びに抱合様式を解明した。
1)グリシン抱合型1β,3α,7α,12α-tetrahydroxy-5β-cholan-24-oic acid(I)をハプテンとして側鎖カルボキシル基を介して結合したウシ血清アルブミン及びウシγグロブロン複合体をウサギ、モルモット、ラット、マウスに免疫して抗血清を作成した。^<125>I標識ヤギ抗ウサギIgGをB/F分離の第二抗体に用いる力価検定の結果、ウサギで産出した抗血清が100〜1000倍の希釈率で優位に結合親和性を示し、種による抗体産出能の違いが認められた。他方、Iの^<125>I標識ヒスタミン誘導体を抗原としたアッセイ系ではブリッジ現象に帰因した親和力の低下を招来し、ELISA法確立に向けての基礎的知見が得られた。
2)固定化3α-hydroxysteroid dehydrogenaseカラムをHPLCのポストリアクタ-とし、生成するNADHの1-メトキシフェナジンメトサルフェ-ト及びミクロペルオキシダ-ゼ/イソルミノ-ルによる化学発光検出によって胎児性胆汁酸のpmolオ-ダ-での高感度一斉分析を可能ならしめた。又、本法の尿試料への応用に際し必須となるsolvolysis条件に改良を加え定量精度の向上が達成された。更に本法を適用して尿中胆汁酸組成を精査したところ、新生児期にはタウリン抱合型1β及び6α水酸化胆汁酸が主要成分として排泄されることが判明し、成人とは異なる代謝様式の存在が実証された。更に、病態との関連から生体肝移植患児の尿中胆汁酸成分を検索した結果、健康成人に近似した組成の排泄様式を示し、消化管機能の回復状況が本法によって明白になった。

研究成果

• [文献書誌] Shigeo Ikegawa: "Preparation and Properties of Antisera against Glyco-3β,12α-dihydroxy-5-cholen-24-oic Acid Linked to Bovine Serum Albumin at the C-3,15α,and C-24 Positions" Chemical Pharmaceutical Bulletin. 37. 2147-2152 (1989)
• [文献書誌] Reijiro Mahara: "Profile Analysis of Bile Acids in Human Fetal and Neonatal Periods by Gas Chromatography-Mass Spectrmetry" Joural of Pharmacobio-Dynamics. 12. s-7 (1989)
• [文献書誌] Takao Kurosawa: "Synthesis of 6-Hydroxylated Bile Acids and Identification of 3α,6α,7α,12α-Tetrahydroxy-5β-cholan-24-oic Acid in Human Meconium and Neonatal Urine" Chemical Pharmaceutical Bulletin. 37. 557-559 (1989)
• [文献書誌] Junichi Shoda: "Altered Metabolism of Bile Acids in Cholestasis:Determination of 1β-and 6α-Hydroxylated Metabolites" Journal of Choromatography. 488. 315-328 (1989)
• [文献書誌] Junichi Shoda: "Concurrent Occurence of 3β,12α-Dihydroxy-5-cholenoic Acid Associated with 3β-Hydroxy-5-cholenoic Acid and Their Preferential Urinary Excretion in Liver Diseases" Journal of Lipid Research. 30. 1233-1242 (1989)
• [文献書誌] Akihiko Kimura: "Unusual 1β-Hydroxylated Bile Acids in Children with a Paucity Interlobular Ducts" Clinica Chimica Acta. 185. 215-218 (1989)
• [文献書誌] 日本分析化学会北海道支部編: "新分析化学実験" 化学同人, 350 (1989)