化学発光反応を用いる脱水素酵素分析システムの開発とその応用

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01571185
• 研究機関: 昭和大学
• 研究代表者: 前田 昌子 昭和大学, 薬学部, 助教授 (00053869)
• 研究分担者: 荒川 秀俊 昭和大学, 薬学部, 専任講師 (70129807) ; 辻 章夫 昭和大学, 薬学部, 教授 (80053784)
• キーワード: 化学発光 / 酵素 / 酵素活性 / NAD(P)H / 脱水素酵素 / ルミノ-ル / 酵素サイクリング / 酵素イムノアッセイ

研究概要

近年、化学および生物発光反応が高感度な検出法として注目され、生体成分の分析法として利用されはじめている。著者らはNAD(P)Hが電子伝達体の1-メトキシフェナジンメチルサルフェ-トにより溶存酸素をO_2^-(H_2O_2)とし、これがミクロペルオキシダ-ゼの共存下イソルミノ-ルと反応して化学発光する反応を見出した。本法では1ピコモルのNAD(P)Hが測定可能であり、酵素サイクリング法を併用するとさらに高感度化が可能である。本化学発光法を用いて以下の検討を行なった。
1.各種の脱水素酵素活性の化学発光測定法:グルコ-ス-6-リン酸脱水素酵素(G6PDH)、アルコ-ル脱水素酵素(ADH)との組み合わせによるアルカリホスファタ-ゼ(ALP)、ガラクト-ス脱水素酵素(GALDH)との組み合わせによるβ-D-ガラクトシダ-ゼについての酵素活性測定法を確立した。
それぞれ1x10^<-18>モル、1x10^<-19>モルおよび1x10^<-20>モルまで測定できた。これらの酵素を標識して17-ヒドロキシプロゲステロンの酵素イムノアッセイに応用した(ラジオイムノアッセイ研究会、1989.11月)。
2.3α-ステロイド脱水素酵素、グルコ-ス脱水素酵素、ヘキソキナ-ゼ/G6PDHをガラスビ-ズに固相化し、血中の胆汁酸、グルコ-ス、ATPをフロ-インジェクション分析法(FIA)で測定する系を確立した。胆汁酸、グルコ-スに関しては国際臨床化学会議に報告し、ATPのFIAに関しては第11回FIA研究会(1989.6月)に報告した。
3.NADHの酵素サイクリング法を確立して30フェムトモルまで測定可能となった(分析化学38,495(1989))。

研究成果

• [文献書誌] Masako MAEDA: "Ultrasensitive Chemiluminescence Assay for NADH using Enzyme Cycling and Its Application to Determination of Enzyme Activity" BUNSEKI KAGAKU. 38. 495-499 (1989)
• [文献書誌] Masako MAEDA: "Chemuluminescent Assay of Various Enzyme Activities and Its Application to Enzyme Immunoassays" J.Bioluminescence & Chemiluminescence. 4. 140-148 (1989)
• [文献書誌] Akio TSUJI: "Chemiluminescence Assay of Co-factors" J.Bioluminescence & Chemiluminescence. 4. 454-462 (1989)
• [文献書誌] Akio TSUJI: "Chemiluminescence Enzyme Immunoassay" Analytical Sciences. 5. 497-506 (1989)
• [文献書誌] Yoshinori UJI: "Chemiluminescent Determination of Nonesterified Fatty Acids in Serum" Clinical Chemistry. 35. 325-326 (1989)
• [文献書誌] Hidetoshi ARAKAWA: "Highly Sensitive Biotin-Labelled Hybridazation Probe" Chemistry and harmaceutical Bulletan. 37. 1831-1833 (1989)
• [文献書誌] 前田昌子(石川栄治編): "エンザイムイムノアッセイ" 東京化学同人, 497 (1989)
• [文献書誌] 前田昌子(今井一洋編): "生物発光と化学発光 基礎と実験" 広川書店, 284 (1989)