胃粘膜(H^+++K^+)ーATPaseの構造機能および調節機構に関する生化学的研究

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01571204
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 前田 正知 大阪大学, 産業科学研究所・生合成化学工業部門, 助教授 (80190297)
• キーワード: (H^++K^+)ーATPase / 胃酸分泌 / ヒトゲノム / 遺伝子 / 転写調節 / ATPア-ゼ / プロトン輸送

研究概要

代表者が既に得ていたブタ(H^++K^+)ーATPaseの_cDNAクロ-ンを用いて、ヒト(H^++K^+)ーATPase の遺伝子を分離した。遺伝子構造が明らかになったのは、本研究が初めてである。15kbの塩基配列中に遺伝子が存在し、全塩基配列の決定を行なった。その結果、(1)ヒトの酵素は1035アミノ酸残基からなり、ラットやブタの酵素と98%のアミノ酸残基が一致していた。(2)(H^++K^+)ーATPaseをコ-ドする領域は22個のイントロンで分断されていた。(3)5'上流域には、種々の転写調節因子による認識配列が存在し、特にペプシノ-ゲン遺伝子の上流に存在する配列を見つかることが興味深い。
(Na^++K^+)ーATPaseと(H^++K^+)ーATPaseのアミノ酸配列を比較すると、約60%が一致しており、しかもギャップを挿入することなしに配列を並べることができる。今回得られた遺伝子の配列を(Na^++K^+)ーATPase(αIII)の遺伝子と比較すると、両者でほどんど(19ケ所)のイントロン挿入位置が一致していた。このことは、両酵素の遺伝子が共通の祖先から、恐らく遺伝子重複の過程を経て進化してきたことを示唆している。
遺伝子の5'上流域は組織特異的発現に重要な働きをしていると推定される。実際に、ラットの各臓器からmRNAを調整し、ノザンハイブリダイゼ-ションを行なうと、(H^++K^+)ーATPaseは胃でのみ特異的に転写されていた。ゲルシフト法やフットプリント法による実験系を確立することができたので、(H^++K^+)ーATPaseの特異的発現に関与する蛋白因子およびそれの認識配列を検索可能になった。
(H^++K^+)ーATPaseのcDNAを哺乳類細胞中で発現できるように、プラズミドにつなぎかえ、導入実験系を確立した。(H^++K^+)ーATPaseに対する抗体を作製し、発現量の定量が可能になった。(H^++K^+)ーATPaseの構造的知見をさらに深めるために、阻害剤(ジシクロヘキシルカルボジイミドとピコプラゾ-ル)の抗果を検討し、結合部位の解析を行ないつつある。

研究成果

• [文献書誌] Shigehiko Tamura: "Pig gastric(H^++K^+)ーATPase:Lysー497 conserved in cation transporting ATPase is modified with pyaridoxal 5'ーphesphate" The Journal of Biological Chemistry. 264. 8580-8584 (1989)
• [文献書誌] Seiji Eya: "Overproduction of truncated subunit a of H^+ーATPase causes growth inhibition of Escherichia cole" Journal of Bacteriology. 171. 6853-6858 (1989)
• [文献書誌] Kenーichi Inatomi: "Amino acid seguence of the α and β subunits of Methanosarana barkeri ATPase deduced from cloud geues : Similarity to subunits of encaryotic vacuolar and FoF1ーATPases" The Journal of Biological Chemistry. 264. 10954-10959 (1989)
• [文献書誌] Yasuo Sugiyama: "Isolation of a gene that encodes a new retinal pnotein、archaerhodopsin、from Halobacteriam sp. ausー1" The Journal of Biological Chemistry. 264. 20859-20862 (1989)
• [文献書誌] Atsuko Iwamoto: "H^+ーATPase γ subunit from Escherichia cole: Role of the conserved carboxyl terminal region" The Journal of Biological Chemistry. 265. (1990)
• [文献書誌] Masatomo Maeda: "Human gasgric(H^++K^+)ーATPase gene: similarity to(Na^++ーK^+)ーATPase gene in exon/intron organization but difference in control region" The Journal of Biological Chemistry. 265. (1990)
• [文献書誌] Masatomo Maeda: "Ann.N.Y.Acad.Sci."Bicarbonate,chloride and Paroton Transport systems"" N.Y.Acad.Sci., (1990)
• [文献書誌] Masatomo Maeda: "Bioenergetics:Molecular Biology,Biochemistry and Pathology(Ed.C.H.Kim)" Plenum New York, (1990)