デオキシヌクレオシドミリン酸プ-ルの不均衡が誘導するDNA二本鎖切断酵素の解析

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01571208
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 綿矢 有佑 岡山大学, 薬学部, 助教授 (90127598)
• 研究分担者: 根岸 和雄 岡山大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (70116490) ; 早津 彦哉 岡山大学, 薬学部, 教授 (10012593)
• キーワード: デオキシヌクレオシドミリン酸 / dNTPプ-ル / 不均衡 / ヌクレオシド代謝 / 5-フルオロデオキシウリジン / 細胞死 / DNA二本鎖切断 / エンドヌクレア-ゼ

研究概要

マウス乳癌由来FM3A細胞に5-フルオロデオキシウリジンを作用させ細胞内dNTPプ-ルの不均衡を起こさせた。この細胞を超音波で破壊した後、10万gで遠心し上清を調製した。次いでこの上清をDEAE-アガロ-スカラムクロマトグラフィ-(食塩濃度匂配)にかけたところ5mMNaclで溶出された分画にDNA二本鎖切断酵素活性があった。さらにこの画分をハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ-(10mM→400mMリン酸カリウム濃度匂配)で部分精製を行った。酵素(endo nuclase)活性は200mMリン酸カリウムで溶出される分画に見い出された。SPS-PAGEでこの分画を分析したことろ6本のバンドが銀染色で観察された。このdNTPプ-ルの不均衡によって誘導されるendo nuclaseの性質をFM3A細胞のDNA及びMl3ファ-ジDNAを基質として調べた。その結果、この酵素は二本鎖DNAを特異的に切断すると共に一本鎖DNAの高次構造を認識して切断する活性を有することが判った。
一方dNTPプ-ルの不均衡時に細胞内に出現するDNA二本鎖断片の5'末端分析をTLC及びHPLCを併用して分析した。5'未満の塩基はチミンとアデニンで全体の70%をしめた。分析結果はアデニン:36%、チミン:34%、シトシン:18%及びグアニン:12%であった。この実験によりdNTPプ-ルの不均衡時に生じるDNA鎖切断はDNAの特異的な部位で起きているものと考えることができる。

研究成果

• [文献書誌] H.Hirota,A.Yoshioka,S.Tanaka,K.Watanabe,T.Otani,J.Minowada,A.Matsuda,T.Ueda and Y.Wataya: "Imbalance of Deoxyribonucleoside Triphosphates,DNA Double-strand Breaks,and Cell Deaih Caused by 2-chlorodeoxy a denosine in Mouse FM3A cells." Cancer Res.49. 915-919 (1989)
• [文献書誌] Y.Wataya,Y.Hirota,A.H-Yoshioka,T.Otani,J.Minowada,A.Matsuda and T.Ueda: "The Mechanism of 2-chlorodeoxyadenosine-induced cell Death" Human Purine and Pyrimidine Metabolism V1,Part B.(New,York,Plenum Publishing Corp.). V1. 227-234 (1989)
• [文献書誌] Y.Wataya,L.Watanabe,S.Yoshida and A.H-Yoshioka: "dNTP impalance and DNA Double Strand Breaks in Mouse FM3A cells and the Mechanism of cell Death" Nucleic Acids Res.21s. 11-12 (1989)
• [文献書誌] M.Yamata,Y.Hirota,J.Sakai,K.Hashigaki,H.Hayatsu and Y.Wataya: "Cethal DNA Double Strand Breaks in Mouse mammary Tumor FM3A cells Treated in vitro with Anti-Neoplastic Tropolone,a,a-Bis-(2-hydroxyt-isopropyetron-3yl)4-methoxytsluene(JCI-3661)" Camcer Res.