生体物質及び病因物質の新しい超高感度測定法の開発に関する基礎的研究

1990 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01580168
• 研究機関: 宮崎医科大学
• 研究代表者: 石川 栄治 宮崎医科大学, 医学部, 教授 (40029939)
• キーワード: 抗原 / 抗体 / ハプテン / 酵素免疫測定法 / 免疫測定法 / ペプチド / βーDーガラクトシダ-ゼ / ペルオキシダ-ゼ

研究概要

生体物質及び病因物質を超高感度で測定するために免疫複合体転移免疫測定法を開発した。2,4ージニトロフェニル(DNP)化ビオチン化免疫反応体、測定物質、標識免疫反応体を同時に反応させ、3者からなる免疫複合体を抗DNP抗体不溶化固相の上にトラップした。固相を洗浄した後、DNPーリジンにより免疫複合体を固相から溶出し、ストレプトアビジン不溶化固相の上に移し換え、固相上の標識を検出した。標識免疫反応体として大腸菌・βーDーガラクトシダ-ゼ標識アフィニティ-精製抗ヒト・フェリチンFab'を用いることにより、ヒト・フェリチンの1milliattomole(lx10^<-21>mol、600分子)を検出することができた。同じ方法により、B型肝炎ウイルス表面抗原、ラット肝オルニチンδーアミノトランスフェラ-ゼなども超高感度で測定できることがわかった。標識免疫反応体として大腸菌・βーDーガラクトシダ-ゼ標識抗原あるいは西洋ワサビ・ペルオキシダ-ゼ標識抗原を用いることにより、抗インスリン抗体、抗サイログロブリン抗体などの測定を、赤血球凝集反応、ELISAなどの従来法と比べて2,000〜4,000倍高感度化することができた。この超高感度免疫複合体転移免疫測定法は、合成ペプチドあるいはリコンビナント蛋白を抗原とする抗HTLVー1抗体、抗HIV抗体の測定にも応用することができ、ゼラチン粒子凝集法、ウエスタンブロット法などの従来法では検出しえない低濃度の抗体を検出することができるので、これらのウイルス感染の診断に役立つことがわかった。これらの免疫複合体転移免疫測定法をさらに高感度化するために、免疫複合体を固相から固相へ2度転移させる方法を開発した。免疫反応体をジスルフィド・フルオレセインにより標識して、抗フルオレセイン抗体不溶化固相から還元により溶出した。この方法を小分子ペプチドの非競合測定法(ヘテロ・サンドイッチ法)に応用して、1attomoleあるいはそれ以下の検出が可能になりつつある。

研究成果

• [文献書誌] Hiroaki Kohno,et al.: "Novel and sensitive enzyme immunoassay(immune complex transfer enzyme immunoassay for(antiーhuman Tーcell leukemia virus type I)IgG in human serum using recombinant gagーenv hybrid protein as antigen." Journal of Clinical Laboratory Analysis. 4. 355-362 (1990)
• [文献書誌] Eiji Ishikawa,et al.: "Novel and sensitive noncompetitive(twoーsite)immunoassay for haptens with emphasis on peptides." Clinical Biochemistry. 23. 445-453 (1990)
• [文献書誌] Seiichi Hashida,et al.: "Detection of one milliattomole of ferritin by novel and ultrasensitive enzyme immunoassay." Journal of Biochemistry. 108. 960-964 (1990)
• [文献書誌] Eiji Ishikawa,et al.: "Ultrasensitive enzyme immunoassay." Clinica Chimica Acta. 194. 51-72 (1990)
• [文献書誌] Takeyuki Kohno,et al.: "Immune complex transfer enzyme immunoassay for(antiーhuman Tーcell leukemia virus type I)IgG in serum using a synthetic peptide,env gp46(188ー209),as antigen." Journal of Clinical Laboratory Analysis. 5. 25-37 (1991)
• [文献書誌] Seiichi Hashida,et al.: "Timeーresolved fluorometric sandwich immunoassay for human growth hormone in serum and urine." Journal of Clinical Laboratory Analysis. 5. 38-42 (1991)