コンドロインチン硫酸を認識する細胞表面レセプタ- 一細胞の基質接着反応の制御因子の可能性

1989 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 01580175
• 研究機関: 愛知医科大学
• 研究代表者: 木全 弘治 愛知医科大学, 分子医科学研究所, 助教授 (10022641)
• キーワード: コンドロインチン硫酸 / プロテオグリカン / 58KD プロテイン / レセプタ- / 細胞接着 / 細胞-基質反応 / 細胞表面膜蛋白質

研究概要

コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、PG-Mのコンドロイチン硫酸部分の細胞表面特異レセプタ-と期待している58KDプロテインについて、今回はその特異抗体の作製と機能を予想させる性質の検討を行った。1)分子の単離と構造:培養ニワトリ胚繊維芽細胞より3%(w/v)CHAPS界面活性剤を用いて可溶化し、PG-M結合アフイニテイ-カラムからコンドロイチン硫酸で特異的に溶出される性質を利用して精製し、ほぼ単一と思われる標品を得た。還元後のSDSゲル電気泳動により分子量58,000付近に互いに密に接近した4本の蛋白質バンドを与える。還元前ではこれより高分子側にスミア-なバンドを与えるから、おそらくジスルフイド結合を介した複合体として細胞表面に存在すると思われた。10^8個の培養細胞から約10μgの蛋白質が得られる。同一と思われる分子が、BHK細胞から同一方法によりほぼ同収量で得られるから、この分子は他動物種の細胞にも広く分布し、重要な機能を担う分子の可能性を示唆した。2)特異抗体の調製:SDSゲル中の蛋白質(4本のサブユニット間の相互分離は困難)をそのままでウサギに免疫して特異抗体の作製に成功した。この抗体は4本のサブユニットの全てに同程度の反応性を示す。またマウスに免疫してモノクロナ-ル抗体の作製を試みた。得られた抗体の一つは、4本のサブユニットバンドの一つのみと反応し、サブユニットが各々異なる遺伝子産物による可能性を示唆した。3)細胞表面蛋白質の証拠:上記の培養細胞から細胞分画法により、様々な細胞膜画分を得て58KDプロテインの分布を調べたところ、期待通り、細胞質膜画分に高濃度に検出された。また作製したポリ、およびモノクロ-ンの抗体を用いた免疫組織染色は、細胞表面に抗原が存在する可能性を示唆した。
これらの基礎実験成果により、58KDプロテインの細胞-基質接着反応の制御因子としての可能性の解析実験の準備は、いよいよ整った。

研究成果

• [文献書誌] Masahito Yamagata: "Regulation of Cell-Substrate Adhesion by Proteoglycans Immobilized on Extracellular Substrates" The Journal of Biological Chemistry. 264. 8012-8018 (1989)
• [文献書誌] Hiroyuki Morita: "Aortic endothelial cells Synthesize a large chondroitin Sulphate Ploteoglycan capable of binding to hyaluronate" Biochemical Journal. 265. 61-68 (1990)
• [文献書誌] Toshikazu Yada: "Occurrence in Chich Embryo Vitreous Humor of a Type IX Collagen proteoglycan with an Extraordinarily Large Chondroitin Sulfate Chain and Short α1 Polypeptide" The Journal of Biological Chemistry. 265. (1990)
• [文献書誌] Masahiko Yoneda: "Hyaluronic Acid Associated with the Surfaces of Cultured Fibroblasts Is Linked to a Serum-derived 85-KDa Protein" The Journal of Biological Chemistry. 265. (1990)
• [文献書誌] Tamayuki Shinomura: "Precartilage Condensation during Skeletal Pattern Formation" Development Growth and Differentation. 32. (1990)
• [文献書誌] Koji Kimata: "Fibrochimerin a novel extracellular matrix molecule-distribution in chick embryos at various stage" Connective Tissue. 21. 23-24 (1989)
• [文献書誌] 木全弘治: "細胞接着 細胞間マトリックスによる細胞分化の制御" 代謝. 26(3). 49-59 (1989)
• [文献書誌] 米田雅彦: "特集 癌転移の分子機構 細胞外マトリックスと転移" 実験医学. 7. 534-541 (1989)
• [文献書誌] 塚原隆司: "コンドロインチン硫酸 プロテオグリカンによる軟骨細胞機能の制御-cmd/cmd マウス軟骨を用いて" 組織培養. 15. 399-403 (1989)
• [文献書誌] 木全弘治: "軟骨の分化と機能維持におけるプロテオグリカンの役割-コンドロインチン硫酸鎖の関与-" 細胞工学. 9. (1990)
• [文献書誌] Tadao Atsumi: "A CHONDROGENIC CELL LINE DERIVED FROM A DIFFERENTIATING CULTURE OF AT805 TERATOCARCINOMA CELLS" Differentiation. (1990)
• [文献書誌] 山形方人: "シリ-ズ分子生物の進歩8細胞コミュニティ-の形成" 丸善株式会社, 16 (1989)