| 研究課題/領域番号 |
01580193
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
松田 佳子 徳島大学, 生物工学科, 教授 (40035449)
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| 研究分担者 |
吉田 哲也 広島大学, 医学部, 教授 (00022905)
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| キーワード | プロアルブミンプロセシング / プロセシングプロテア-ゼ / F_0タンパク質 / F_1タンパク質 / パラミクソウィルス / トランスゴルジ膜 |
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| 研究概要 |
一夜絶食したラット肝より、粗ミクロソ-ム分画を調製し、さらに小胞体、シスゴルジ、トランスゴルジ膜をショ糖密度勾配遠心法で精製した。各オルガネラの標識酵素活性を測定し、トランスゴルジ膜は粗ミクロソ-ム分画に比してガラクトシルトランスフェラ-ゼの比活性が約30倍に上昇していることから、極めて純度の高いトランスゴルジ膜が得られた。精製トランスゴルジ膜を高塩溶液で洗浄した後で界面活性剤Chapsを含む緩衝液で抽出液を調製した。プロセシングプロテア-ゼの活性は二つの方法で測定した。1.初代培養ラット肝細胞を^<35>S-メチオニンで10分間パルス標識することにより、^<35>S-プロアルブミンを生合成させ、抗ラット・アルブミン抗体のアフィニティクロマトグラフィ-で精製する。^<35>S-プロアルブミンと酵素を反応させて精製する^<35>S-アルブミンを等電点電気泳動法で分離して測定する。2.パラミクソウィルスをかけた細胞に^<35>S-メチオニンをとりこませて24時間培養し、^<35>S-F_0タンパク質を含有するウィルス粒子を取出し、^<35>S-F_0として酵素と反応させて^<35>S-F_1タンパク質の生成を測定する。粗ミクロソ-ム分画より精製した膜分画でのプロセシングプロテア-ゼ活性を測定すると、プロアルブミンのプロセシング活性はトランスゴルジ膜にのみ存在するが、F_0タンパク質のプロセシング活性はトランスゴルジ膜に多いものの、他のミクロソ-ム分画にも認められた。さらにプロアルブミンプロセシングはトランスゴルジ膜のChaps抽出液中に存在するが、F_0タンパク質プロセシング活性はそれに加えて膜残渣にも活性が認められた。プロアルブミンプロセシング活性は等電点電気泳動法で2つのピ-クが認められたが、F_0タンパク質のプロセシング活性はプロアルブミンプロセシングと同じ酵素で触媒されるものの他に異なったプロテア-ゼの関与が考えられる。今後更にこれらのプロセシングプロテア-ゼの完全調製を目指している。
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